[发明专利]一株宇佐美曲霉突变菌株及其在制备酸性蛋白酶中的应用

说明书

【技术领域】

本发明涉及一株宇佐美曲霉突变菌株(Aspergillus sp.)M1223及其在制备酸性蛋白酶中的应用，属于微生物技术领域。 

【背景技术】

宇佐美曲霉是黑曲霉的一种，工业上广泛用于酸性蛋白酶、木聚糖酶、糖化酶等的生产。蛋白酶是一类水解蛋白质的肽键、生成氨基酸及多肽的酶，根据作用条件的不同，可分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶。酸性蛋白酶是酶制剂工业的重要酶种，广泛应用于医药、饲料、纺织和酿造工业中，具有较大的市场潜力。微生物源酸性蛋白酶的研制始于20世纪60年代，目前，国内外已发现能分泌酸性蛋白酶的主要是各种霉菌，如黑曲霉、米曲霉、斋藤曲霉、根霉以及它们的变异株、突变株等，应用于工业化生产的主要菌种是黑曲霉。 

【发明内容】

本发明的目的是提供一株高产酸性蛋白酶的菌株宇佐美曲霉(Aspergillus sp.)M1223，以其为生产菌株，利用深层液态发酵技术制备酸性蛋白酶，并初步探讨其对不同蛋白质的降解作用。 

本发明提供的产酸性蛋白酶的菌株是从乳制品加工厂污泥中筛选得到，通过26S rDNA鉴定为黑曲霉菌群，结合生理生化鉴定确定为宇佐美曲霉，该菌种经等离子束诱变得到一株高产酸性蛋白的突变株，命名为(Aspergillus sp.)M1223，现保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCCNo.5335，保藏日期为2011年10月12日。 

对该菌株的相关研究得到如下结论： 

1.培养基 

筛选培养基(g/L)：干酪素3，磷酸氢二钾1，硫酸镁0.5，氯化钾0.5，硫酸亚铁0.01，蔗糖30，琼脂20g，PH自然。 

种子培养基(g/L)：硝酸钠3，磷酸氢二钾1，硫酸镁0.5，氯化钾0.5，硫酸亚铁0.01，蔗糖30，PH自然。 

发酵培养基(g/L)：豆饼粉30～100，玉米粉5～15，磷酸氢二钠2～5，氯化铵10～15，氯化钙2～5，PH自然。 

2.培养条件 

种子培养条件：以孢子接种，在含有30ml种子培养基的250ml摇瓶中，接种量105～6个孢子/ml，200r/min、30℃发酵培养2～3天。 

摇瓶培养条件：在含有50ml发酵培养基的500ml摇瓶中，接种量5％(V/V)，200r/min、30℃发酵培养3～4天。 

5L罐发酵条件：在含有3L发酵培养基的5L发酵罐中，接种量5％(V/V)，500r/min、通气量0.8～1vvm，30℃发酵培养3～4天。 

3.粗酶性质： 

(1)以酪蛋白为作用底物，该酶最适作用温度为40℃，最适作用pH为3.0。 

(2)最适作用条件下，酶活性达到5600U/ml。 

(3)该酶分子量在45KD左右。 

本发明公开的宇佐美曲霉(Aspergillus sp.)M1223通过液态深层发酵技术高产酸性蛋白酶，该酶可以在酸性条件下有效降解玉米醇溶蛋白、麦谷蛋白、细胞角蛋白等，在食品、酿造、皮毛处理等方面具有较好的应用潜力。 

【具体实施方式】

实施例1：产酶菌株的筛选与诱变选育 

初筛：在乳制品加工厂周围取土样1g溶于50ml无菌水中，摇匀制成土壤悬液，将土壤悬液稀释不同倍数后取200μl涂布于上述筛选培养基的固体平板中，培养2～3天后，挑取水解圈/直径大的几株单菌落进行划线分离，并保存于种子斜面培养基。 

复筛：将初筛得到的几株菌进行摇瓶复筛，摇瓶培养基为上述的发酵培养基，在30℃，200r/min，培养3～4天后测发酵液中酶活，得到产酶最高的一株菌命名为M12。 

等离子束诱变：以上述菌株为出发菌株，进行8个剂量的N⁺离子束诱变，诱变剂量分别为(20，40，60，80，100，150，200，300)*10¹⁴，经过平板初筛、摇瓶复筛得到产酶最高的一株突变株，命名为M1223。 

实施例2：菌种鉴定