[发明专利]一种利用侧芽孢杆菌生产抗菌肽的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物发酵领域，具体地，涉及侧芽孢杆菌发酵制备抗菌肽的工艺方法。

背景技术

抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMP)是生物产生的一种具有抗菌活性的多肽，一般分子量小于5kD，氨基酸数目小于100。与抗生素相比，抗菌肽安全性高，对人和动物正常细胞无害，属无毒副作用、无残留、无致细菌耐药性的一类生物防腐剂。它具有较广的抑菌谱，不仅能够抑制细菌，而且对真菌、病毒及癌细胞也有一定的抑杀作用。此外，还具有稳定性高、耐热性好、溶解性好等特点。这些优点使其在食品工业和饲料工业中有广阔的应用前景。

在食品防腐领域，目前使用最广泛的抗菌肽是由乳酸链球菌产生的乳酸链球菌肽(Nisin)。Nisin可以被消化道中酶降解，是一种对人体无毒的天然食品防腐剂，已被广泛应用于乳制品、肉制品、罐装食品和饮料的防腐保鲜。然而Nisin也存在一些局限性，例如：抑菌谱较窄，仅对亲缘关系相近的革兰氏阳性菌有显著的抑菌作用，而对革兰氏阴性菌和真菌没有活性；在中性和碱性条件下对热不稳定，从而使其在食品中的应用受到了一定限制。作为饲料添加剂，抗菌肽具有显著的防病促生长效果，近年来受到国内外的极大关注，已成为饲用抗生素替代品的研究热点之一。例如：柞蚕抗菌肽应用于预防及治疗鸡白痢效果明显；蚕抗菌肽可减轻断奶仔猪的腹泻；酵母基因工程抗菌肽可促进仔鸡生产和减少排泄物氮含量，对粤黄鸡具有促生长、保健和治疗疾病的功能。抗菌肽酵母制剂作饲料添加剂的应用效果显著，而其它大规模运用于生产实际的抗菌肽添加剂不多见。

迄今为止，已在许多生物包括动物、植物及微生物中发现了600多种内源性抗菌肽。由于植物、动物源抗菌肽的来源有限，限制了其在实际中的大规模应用，而利用微生物发酵生产抗菌肽具有明显的优势：周期短、成本低、且不受季节和气候等环境因素的影响，可实现大规模工业化生产，是克服抗菌肽实际应用技术瓶颈的有利途径。许多微生物可以产生抗菌肽，当前的研究主要集中在乳酸菌，然而乳酸菌来源的抗菌肽大多存在抗菌谱窄、耐热性差等问题，因此，进一步开发抗菌谱更广，性能优良的抗菌肽防腐剂显得更加迫切。芽孢杆菌和类芽孢杆菌产生的抗菌肽普遍抑菌谱广、稳定性高，开始引起国内外研究人员的注意，而对芽孢杆菌和类芽孢杆菌产生的抗菌肽报道不多。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种利用侧孢短芽饱杆菌生产抗菌肽的方法。

本发明的第二个目的在于提供上述方法生产的抗菌肽在食品防腐和饲料添加剂中的应用。

侧孢短芽孢杆菌，也被称为侧孢芽孢杆菌，细胞杆状，形成椭圆形芽孢，芽孢位于芽孢囊一侧，好氧，最适合生长温度为28-30℃，产生大量几丁质酶，可以抑制多种真菌。侧孢芽孢杆菌已被用来生产功能性食品和饲用微生态制剂，是食品、饲料中允许使用的微生物，具有极高的安全性，是一种潜在的益生菌。

本发明提供的发酵生产抗菌肽的方法，是以侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporu)为菌种，接入碳源、氮源及无机盐组成的发酵培养基中，发酵制备得到抗菌肽。

本发明发酵生产抗菌肽的方法，其包括步骤：

1)种子培养

将侧孢芽孢杆菌接入灭菌后的种子培养基中，于30-37℃培养12-16h，得到种子液，含菌量为10⁷-10⁸cfu/ml。

种子培养基的配制如下：牛肉膏0.5-1g，蛋白胨1-2g，氯化钠0.5-0.7g，蒸馏水100ml，pH 7.2-7.4；

2)发酵培养

将步骤1)得到的种子液按接种量1％-3％接种到发酵培养基中进行发酵培养，培养条件：30-40℃，摇床转速180-280r/min，发酵培养12-24h。

所述发酵培养基分别含碳源0.5％-3％，氮源0.5％-3.5％，无机盐0.005％-0.2％，均为质量体积比。

上述步骤1)的侧孢芽孢杆菌为侧孢芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)AS1.864，(Brevibacillus laterosporus)AS1.2738，侧孢芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)AS1.2739，侧孢芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)CICC6014中的一种或多种。

其中步骤1)所述的种子培养，其培养条件为30℃，培养12h。

其中步骤1)所述的种子培养基，为牛肉膏0.5g，蛋白胨1g，氯化钠0.5g，水100ml，pH 7.3；