[发明专利]高甘露糖蛋白质和产生高甘露糖蛋白质的方法

说明书

发明背景

戈谢病(Gaucher病)是一种常染色体隐性溶酶体贮积病，其特征在于溶酶体酶葡糖脑苷脂酶(GCB)缺乏。GCB水解在白细胞和红细胞膜中的鞘糖脂降解后形成的糖脂葡糖脑苷脂。该酶的缺乏导致葡糖脑苷脂在位于戈谢病患者的肝脏、脾脏和骨髓中的吞噬细胞溶酶体中大量积累。这些分子的积累引起多种临床表现，包括脾肿大、肝肿大、骨骼疾病、血小板减少和贫血(Beutler等人，戈谢病；《遗传性疾病的代谢和分子基础》(McGraw-Hill，Inc.，纽约，1995)，第2625-2639页)。

该病患者的治疗包括施用止痛剂以缓解骨痛、血液和血小板输注，以及某些情况下的脾切除术。对于骨腐烂的患者关节置换术有时也是必要的。

用GCB进行酶置换治疗已经作为戈谢病的一种疗法。当前对戈谢病患者的治疗包括施用碳水化合物重建(remodel)的GCB，它来源于人胎盘或用GCB表达构件转染的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，分别被称为阿糖苷酶(alglucerase)或imiglucerase。这种治疗极其昂贵，部分是由于为了将该酶导向网状内皮来源细胞上的甘露糖受体，从GCB中除去糖以暴露复合聚糖的三甘露糖基核心的成本。人胎盘组织的缺乏(在阿糖苷酶情况中)、复杂纯化方案和需要的相对大量的碳水化合物重建的GCB全都计入治疗成本。

发明概述

本发明部分基于以下发现，防止去除远离蛋白质(如一种溶酶体贮积酶)前体寡糖链五糖核心的一个或多个甘露糖残基，能获得高甘露糖蛋白质，如高甘露糖葡糖脑苷脂酶(hmGCB)。这些高甘露糖蛋白质能用来将蛋白质导向表达甘露糖受体的细胞。这些细胞包括网状内皮来源的细胞，包括巨噬细胞、枯否细胞和组织细胞。因此，这些高甘露糖蛋白质能用来例如将受体介导的胞吞输送定向溶酶体，以治疗多种溶酶体贮积病。

特别是，已经发现hmGCB可有效地定向甘露糖受体。甘露糖受体存在于巨噬细胞和其它细胞(如树突细胞、心肌细胞和神经胶质细胞)上，有助于受体介导的胞吞。戈谢病患者中GCB的缺乏导致葡糖脑苷脂主要在网状内皮来源的细胞(包括巨噬细胞、枯否细胞和组织细胞)中积累。由于这些细胞在其表面表达甘露糖受体，能用hmGCB通过受体介导的胞吞作用将校正酶的输送有效地定向溶酶体，从而治疗戈谢病。令人惊讶的是，发现巨噬细胞对hmGCB的摄取比细胞分泌的GCB的摄取增多。

因此，一方面，本发明表征一种生产高甘露糖葡糖脑苷脂酶(hmGCB)制剂的方法。该方法包括：

提供一种能表达GCB的细胞；和

在防止去除远离GCB前体寡糖的五糖核心的至少一个甘露糖残基的条件下生产含有前体寡糖的GCB，从而生产一种hmGCB制剂。

在一个优选实施方案中，GCB是人GCB。在一个优选实施方案中，细胞是人细胞。

在一个优选实施方案中，防止去除远离五糖核心的一个或多个α1，2甘露糖残基；远离五糖核心的α1，3甘露糖残基；和/或防止去除远离五糖核心的α1，6甘露糖残基。优选地，防止去除远离五糖核心的一个或多个α1，2甘露糖残基。

在一个优选实施方案中，该方法包括使细胞接触一种物质，该物质可防止去除远离GCB前体寡糖五糖核心的至少一个甘露糖残基，例如防止去除远离五糖核心的一个或多个α1，2甘露糖残基，远离五糖核心的α1，3甘露糖残基和/或远离五糖核心的α1，6甘露糖残基。优选地，防止去除远离五糖核心的一个或多个α1，2甘露糖残基。

在一个优选实施方案中，该方法包括使细胞接触一种物质，该物质可防止去除远离GCB前体寡糖五糖核心的至少一个甘露糖残基，其中该物质是一种甘露糖苷酶抑制剂。该甘露糖苷酶抑制剂可以是1类加工甘露糖苷酶抑制剂、2类加工甘露糖苷酶抑制剂或此两者。1类加工甘露糖苷酶抑制剂可以是kifunensine、deoxymannojirimycin或类似抑制剂中的一种或多种。优选地，1类加工甘露糖苷酶抑制剂是kifunensine。有用的2类加工甘露糖苷酶抑制剂可包括苦马豆素、mannostatin、6-脱氧-1，4-双脱氧-1，4-亚氨基-D-甘露糖醇(6-脱氧-DIM)和6-脱氧-6-氟-1，4-亚氨基-D-甘露糖醇(6-脱氧-6-氟-DIM)中的一种或多种。优选地，2类加工甘露糖苷酶抑制剂是苦马豆素。

在一个优选实施方案中，甘露糖苷酶抑制剂以约0.025-20.0μg/ml、0.05-10μg/ml、0.05-5μg/ml、优选地约0.1-2.0μg/ml的浓度存在。