[发明专利]一种分离培养内皮克隆形成细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种分离培养内皮克隆形成细胞的方法，具体涉及一种从脐带中分离培养内皮克隆形成细胞的方法。

背景技术

内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是血管内皮细胞的前体细胞，亦是具有向成熟血管内皮细胞分化能力的祖细胞。许多研究表明EPCs参与胚胎血管和出生后血管发生过程，具有新生血管、修复血管损伤、分泌多种促进新生血管生长因子的作用，在靶向治疗缺血性疾病、炎症性疾病、恶性肿瘤、防止血管再狭窄、血管创伤愈合、促进造血恢复等过程中有着重要临床应用前景。目前EPCs主要来源于外周血、骨髓和脐带血，其获得主要存在以下问题：循环血中的EPCs数目非常低，骨髓取材不便，脐带血取材及操作困难等。内皮祖细胞分离培养的难度和数量的稀少成为未来临床应用的一个瓶颈，因此，如何有效获得EPCs成了实验研究和临床应用急需解决的难题，从新的来源寻找EPCs，以克服骨髓等来源的不足成为必要。

EPCs有早期EPCs及晚期EPCs两种亚型，晚期EPCs又称内皮克隆形成细胞(endothelial colony forming cells，ECFCs)，或内皮外向生长细胞，而ECFCs作为内皮祖细胞的一种亚群，具有较高的增殖能力和较强的成血管活性。研究证实ECFCs更适用于心血管疾病等的治疗，因此，获得ECFCs对内皮祖细胞实验研究和临床应用非常关键。

脐带由羊膜、华氏胶、两个脐动脉和两个脐静脉组成。2005年Ingram和2006年Cherqui两位学者证实血管壁内存在EPCs。脐带来源广泛，取材容易，对供者无不利影响，无道德伦理问题的限制，如果能够从脐带中获得EPCs，将会成为骨髓等来源EPCs的理想替代来源。

发明内容

本发明的目的在于提供一种脐带来源的ECFCs的制备方法，为ECFCs的获得提供一种具有很大优越性的新来源。

本发明的一个方面涉及一种从脐带中分离培养内皮克隆形成细胞的方法，其包括以下步骤：

(1)用消化酶消化离体脐带的脐静脉血管内膜；

(2)冲洗消化后的脐静脉，收集冲洗液；

(3)取冲洗液进行细胞培养，得到内皮克隆形成细胞。

在本发明中，所述脐带来源于人或哺乳动物；在本发明的一个实施方案中，所述脐带来源于人。

在本发明中，所述消化酶可以为任何能够消化血管内膜的酶，例如可为胶原酶、透明质酸酶或脱氧核糖核酸酶I型；在本发明的一个实施方案中，所述消化酶为胶原酶。在本发明的一个具体实施方案中，所述消化酶为II型胶原酶。

根据本发明第一方面任一项所述的方法，其中所述用消化酶消化脐静脉血管内膜前还包括冲洗脐带外周及脐静脉腔内残留血液的步骤。

根据本发明第一方面任一项所述的方法，其中所述用消化酶消化脐静脉血管内膜的方法为将消化酶注入脐静脉腔内；任选地，在将消化酶注入脐静脉腔内之前还包括结扎脐静脉一端的步骤。

在本发明的一个实施方案中，将消化酶注入脐静脉内后，将脐带放入一定的缓冲液中以维持细胞的活性状态。

根据本发明第一方面任一项所述的方法，所述用消化酶消化的条件根据不同的消化酶确定。在本发明的一个实施方案中，所述消化酶为胶原酶，其反应条件为37℃温育。

根据本发明第一方面任一项所述的方法，其中所述取冲洗液进行细胞培养之前还包括将冲洗液进行浓缩的步骤；所述浓缩的方法例如为先离心，然后弃上清。

在本发明中，所述浓缩是指收集冲洗液中细胞的过程，例如可以采用离心后弃上清或静止后弃上清方法进行浓缩；在本发明的一个实施方案中，通过离心、弃上清的方式收集细胞。

在本发明的实施方案中，所述离心的条件为收集细胞的离心条件，例如为1000-2000rpm，离心10-20min；在本发明的一个具体实施方案中，为1500rpm，10min；离心温度一般为4℃。

根据本发明第一方面任一项所述的方法，其中所述胶原酶的浓度为0.05-0.2％重量体积比，例如为0.075-0.15％重量体积比；在本发明的一个实施方案中，所述浓度为0.1％重量体积比。

根据本发明第一方面任一项所述的方法，其中所述的用消化酶消化的时间为30-120min，例如为45-90min，例如为60-80min；在本发明的一个实施方案中，为60min。