[发明专利]一种高产AD/ADD的菌株及高效生产AD/ADD的方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种利用高产菌株发酵生产AD和/或ADD的方法。

背景技术

雄甾-4-烯-3.17-二酮(androst-4-ene-3，17-dione，简称雄烯二酮、AD)和雄甾-1，-4-二烯-3.17-二酮(androsta-1，4-diene-3，17-dione，简称雄二烯二酮、ADD)均是重要的甾类药物中间体，雄烯二酮(AD)既可作为雄性激素、促蛋白合成激素等激素类物质的前体，也可用于合成螺甾内酯、氢化可的松、氧化泼尼松，地塞米松等药物；而雄二烯二酮(ADD)可用于雌性激素、口服避孕药等药物的合成。相对ADD而言，AD在医药行业的使用范围更广更深，超过90％甾体激素类药物都是以AD作为基础原料进行生产的。

到目前为止，AD及ADD的制备方法主要有薯蓣皂苷元途径的化学合成法和甾醇物质侧链降解的微生物转化法。由于穿地龙等薯蓣类植物日益枯竭，而且化学合成的污染大，成本高，所以其逐步被微生物转化法所取代。现已发现，微生物中如节杆菌属、短杆菌属、诺卡氏菌属、链霉菌属和分枝杆菌属能将甾醇类物质降解为二氧化碳和水，同时代谢过程中伴有AD/ADD等中间产物的形成。据报道，分枝杆菌(Mycobacterium)MB3683和MB3605是比较常用AD/ADD的生产菌株，常规的生产方法是先在适当的培养基中培养菌体，然后将菌体移至含有甾醇类物质的发酵罐中，经过大约120-168小时的生物转化生产AD/ADD，然后用适当的有机溶剂将AD/ADD进行萃取、分离、结晶并精制，即可得到白色的结晶粉末状的AD/ADD。

但利用甾醇物质的微生物转化法中，受限于甾醇类物质在水溶性的培养基中溶解度很小，导致微生物无法充分利用并将其转化，因而导致发酵周期较长，且AD/ADD的有效转化率很低。一般为了解决这一问题，通常会往培养基加入司盘(Span)、吐温(Tween)等乳化剂以改善底物的分散度，进而增加微生物与底物的接触机率以期望提高整个体系的生物转化率，但是实际效果并不明显。现有技术中，也报道了一些通过添加乙醇、甘油等有机溶剂的单相发酵系统，能够提高甾醇类物质的溶解性，提高微生物的生物转化率；但是添加过多的有机溶剂对细胞有毒害作用，最终也会影响产品的得率。

针对上述问题，现有技术中开发出利用如聚乙二醇(PEG)，聚丙二醇(PPG)等聚合物与发酵液构成的双水相发酵系统提升AD/ADD的产量，该双水相发酵系统能提高甾醇类物质的溶解度，而且对微生物的生长繁殖影响不大，进而提高AD/ADD的转化率，但是受限于聚合物的价格因素而阻碍其在工业领域的大规模生产及应用。此外，还有一种利用与水不相容的有机溶剂如辛醇等，与发酵液形成不相溶的双液相系统，该系统的优点是甾醇类物质的溶解度和生物转化率都有比较明显的提高，而且AD/ADD几乎全部集中在有机相，分离比较容易；但缺点是溶剂对微生物的毒害作用、以及由于溶剂挥发所产生的安全问题，均不利于工业推广。

中国专利CN101525651A公开了一种双液相系统中生物降解植物甾醇制备“雄烯二酮”的方法，该专利通过添加葵花油作为有机相，与水相发酵液形成油/水双液相培养系统，并利用分枝杆菌Mycobacterium sp-UV-8在此系统中繁殖并有效转化植物甾醇生产AD，整体转化率在80％左右，但是该系统中葵花油用量至少达到20％V/V，而投料量却只有0.6％，虽然其转化率可以达到80％，但单次生产量仍然很低，远达不到生产要求。

中国专利CN1639154A公开了一种将植物甾醇发酵制备雄二烯二酮的方法，该方法通过镰孢菌属菌株(Fusarium)利用AD合成ADD，该法首先利用分枝杆菌Mycobacterium MB3683将植物甾醇的侧链降解为AD或者直接提供AD作为底物，然后利用事先培养好的镰孢菌属(Fusarium)培养物移入上述含有AD的发酵液中进行生物转化，并最终获得所需的ADD，随后将其分离并纯化即可。该法虽然可以获得高纯度ADD，但是整个体系的甾醇投料量只有1.0％，且两阶段培养周期耗时高达95～136h之间，而AD转化为ADD的转化率只有25-40％，这也就意味着若由甾醇直接转化为ADD的转化率只有20-30％，不仅转化率很低；而且所获得ADD晶体中含有约5％左右的AD，需要通过其他方法才能分离去除。