[发明专利]重组人源LECT2蛋白在毕赤酵母中的表达及纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程领域，尤其是涉及重组人源LECT2蛋白在毕赤酵母中的分泌表达和纯化制备方法。

背景技术

LECT2蛋白，即白细胞衍生趋化因子2 (leukocyte cell-derived chemotaxin 2)是一个多功能的蛋白质，分子量约为16 kDa，含三个分子内二硫键。LECT2蛋白最初被鉴定为趋化因子，但越来越多的文献表明，LECT2蛋白更类似于细胞因子，是一个多功能的蛋白。报道表明，在小鼠刀豆碱性肝损伤模型试验中，LECT2蛋白的表达瞬时减少；在类风湿性关节炎发展中，血液LECT2蛋白含量与病症严重程度呈负相关；它能触发肝再生的早期事件，表现为肝细胞增殖的伴生抑制；它能通过抑制血管增生达到抑制肝癌的生长和迁移；它也与肾淀粉样病变紧密相关。因此，LECT2蛋白被认为是一种潜在的相关疾病治疗药物和分子诊断标记。

LECT2蛋白的制备可以从血清中分离纯化，但由于血清少，含量低，如果从血清中分离提取LECT2蛋白，产量极低，成本极高，并且不同物种的LECT2蛋白不能替代，因此无法规模化生产。在外源基因表达系统中，原核表达系统产量高，成本低，但用于表达真核基因有重大缺陷，由于缺少翻译后的加工修饰，表达产物的生物学活性往往会受到影响。真核表达系统中的中国仓鼠卵巢细胞表达系统，活性较高，但产量低，并且细胞培养成本很高。真核表达系统中的巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统，表达量大，并且具有糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻译后加工修饰功能，重组蛋白生物学活性高，是表达真核基因的理想系统之一。但是，目前国内外均未见采用毕赤酵母表达制备重组人源LECT2蛋白并进一步进行纯化制备的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种表达水平高、生产成本低及产量高的重组人源LECT2蛋白在毕赤酵母中的表达及纯化方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：将人工合成的人源LECT2基因插入胞外表达载体pPICZαA中；酶切线性化后电击导入毕赤酵母X33中，获得重组工程菌株；经过摇瓶发酵和甲醇诱导，实现重组人源LECT2蛋白的分泌表达；再利用柱层析进行纯化制备得到纯度为95%以上的重组人源LECT2蛋白，步骤如下：

（1）构建重组表达质粒

抽取人外周血细胞中RNA，逆转录合成cDNA得到人源LECT2蛋白基因序列，登录号为NM002302，以此为模板设计引物进行PCR扩增人源LECT2蛋白，将含人源LECT2基因的PCR扩增产物用限制性内切酶EcoRI和KpnI双酶切，将用相同限制性内切酶EcoRI和KpnI双酶切的的质粒pPICZαA与酶切后的PCR产物用T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5a中，得到重组表达质粒pPICZα-LECT2；

（2）筛选高表达重组工程菌株

将重组表达质粒pPICZα-LECT2经SacI酶切后，将感受态毕赤酵母X33细胞与经SacI酶切线性化的重组表达质粒pPICZα-LECT2按比例16ul:1ug混合后，进行电击转化获得转化子，将转化子经博莱霉Zeocin高抗性筛选及PCR鉴定，阳性克隆为重组工程菌X33/ pPICZα-LECT2；将获得的博莱霉高抗性重组工程菌株X33/ pPICZα-LECT2接种于BMGY培养基中，培养至OD600达2.0～6.0收集细胞，重悬于BMMY培养基中，0.5%甲醇诱导表达，上清液用SDS-PAGE蛋白电泳及Western blot免疫印迹鉴定分析，筛选表达水平为60-70mg/L的菌株，得到高表达重组工程菌株；

（3）高表达酵母菌株扩大培养

将高表达重组工程菌株接种于100mL BMGY培养基生长，30 ℃培养22-26小时直至OD600达2.0～6.0，1500rpm离心5min收集菌体，然后将菌体转入400mL BMMY培养基中进行甲醇诱导，0.5%甲醇诱导表达，30℃继续培养70-75小时，每24小时补加一次甲醇，使毕赤酵母分泌表达重组人源LECT2蛋白；

（4）重组人源LECT2蛋白的纯化

收集步骤（3）扩大发酵后得到的上清液，经强阳离子交换柱层析，收集第二洗脱峰的洗脱液浓缩后，再经superdex 75分子筛分离纯化，收集最高洗脱峰的洗脱液进行真空冷冻干燥，即得到纯度达95%以上的重组人源LECT2蛋白。

步骤（1）中PCR引物序列如下：