[发明专利]重组人源LECT2蛋白在毕赤酵母中的表达及纯化方法

权利要求书

1.一种重组人源LECT2蛋白在毕赤酵母中的表达及纯化方法，其特征在于步骤如下：

（1）构建重组表达质粒

抽取人外周血细胞中RNA，逆转录合成cDNA得到人源LECT2蛋白基因序列，登录号为NM002302，以此为模板设计引物进行PCR扩增人源LECT2蛋白，将含人源LECT2基因的PCR扩增产物用限制性内切酶EcoRI和KpnI双酶切，将用相同限制性内切酶EcoRI和KpnI双酶切的质粒pPICZαA与酶切后的PCR产物用T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌DH5a中，得到重组表达质粒pPICZα-LECT2；

（2）筛选高表达重组工程菌株

将重组表达质粒pPICZα-LECT2经SacI酶切后，将感受态毕赤酵母X33细胞与经SacI酶切线性化的重组表达质粒pPICZα-LECT2按比例16ul:1ug混合后，进行电击转化获得转化子，将转化子经博莱霉Zeocin高抗性筛选及PCR鉴定，阳性克隆为重组工程菌X33/ pPICZα-LECT2；将获得的博莱霉高抗性重组工程菌株X33/ pPICZα-LECT2接种于BMGY培养基中，培养至OD600达2.0～6.0收集细胞，重悬于BMMY培养基中，0.5%甲醇诱导表达，上清液用SDS-PAGE蛋白电泳及Western blot免疫印迹鉴定分析，筛选表达水平为60-70mg/L的菌株，得到高表达重组工程菌株；

（3）高表达酵母菌株扩大培养

将高表达重组工程菌株接种于100mL BMGY培养基生长，30 ℃培养22-26小时直至OD600达2.0～6.0，1500rpm离心5min收集菌体，然后将菌体转入400mL BMMY培养基中进行甲醇诱导，0.5%甲醇诱导表达，30℃继续培养70-75小时，每24小时补加一次甲醇，使毕赤酵母分泌表达重组人源LECT2蛋白；

（4）重组人源LECT2蛋白的纯化

收集步骤（3）扩大发酵后得到的上清液，经强阳离子交换柱层析，收集第二洗脱峰的洗脱液浓缩后，再经superdex 75分子筛分离纯化，收集最高洗脱峰的洗脱液进行真空冷冻干燥，即得到纯度达95%以上的重组人源LECT2蛋白。

2.根据权利要求1所述的重组人源LECT2蛋白在毕赤酵母中的表达及纯化方法，其特征在于步骤（1）中PCR引物序列如下：

正向引物为5’-GGAATTCGGGCCATGGGCTAATATATG-3’，

反向引物为5’-GGGTACCCAGGTATGCAGTAGGGTCAC-3’。

3.根据权利要求1所述的重组人源LECT2蛋白在毕赤酵母中的表达及纯化方法，其特征在于步骤（2）中所述的感受态毕赤酵母X33的制备方法如下：将毕赤酵母X33接种于YPD培养基中，30℃振荡培养至OD600为1.3-1.5，离心收集菌体，用预冷无菌水和1 mol/L山梨醇各洗一次，最后用1 mol/L山梨醇200μL悬浮，即得到X33感受态毕赤酵母。