[发明专利]一种快速提取质粒DNA的试剂盒及其提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及的是一种快速提取质粒DNA的试剂盒及其提取方法。

背景技术

细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。

质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取。

碱裂解法是一种应用最为广泛的现有制备质粒DNA的方法，碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc/KAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

碱裂解法存在以下不足：

①耗时较长：由于使用此方法提取质粒DNA需要提前人工配制数种新鲜溶液，导致实验过程延长

②成功率较低：现有技术由于溶液配比的不适宜，容易导致DNA提取的失败

③提取到的DNA纯度较低：普通eppendorf管对DNA没有特别的吸附作用，会导致DNA的流失和提取纯度降低。若要再次纯化DNA，需要用到有毒的苯酚等化学药剂

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种快速提取质粒DNA的试剂盒及其提取方法。

本发明的技术方案如下：

一种快速提取质粒DNA的试剂盒，该试剂盒由溶液I-VI组成：

溶液I：50mM Tris-HCI和10mM EDTA，pH＝8.0(25℃)，50微克/毫升RNaseA；

溶液II：0.2M NaOH和1％ SDS；

溶液III：4M盐酸胍和0.5M醋酸钾，pH＝4.2；

溶液IV：5M盐酸胍，20mM Tris-HCI，pH6.6(25℃)，使用前加入乙醇，乙醇浓度为38％；

溶液V：20mM NaCL，2mM Tris-HCI，pH 7.5(25℃)，使用前加入乙醇，乙醇浓度为80％；

溶液VI：10mM Tris-HCI，pH 8.5(25℃)。

应用权利要求1所述试剂盒的质粒DNA提取方法，包括以下步骤：A1、用1.5ml离心管收集1-5ml菌液。12,000rpm离心1min，弃上清；

A2、加入250μl溶液I，漩涡剧烈振荡直至菌体完全重新悬浮；室温静置1-2min；

A3、加入250μl溶液II，轻柔地反复颠倒混匀5-6次；室温静置1-2min，使菌体充分裂解，直至形成澄清的裂解溶液；

A4、加入350μl溶液III，立即轻柔地反复颠倒混匀5-6次；

A5、12,000rpm室温离心10min，收集上清；

A6、将上清置于DNA纯化柱中，静置1-2min；

A7、12,000rpm离心1min，弃滤液；

A8、加入500μl溶液IV，12,000rpm离心1min，弃滤液；

A9、加入500μl溶液V，12,000rpm离心1min，弃滤液；

A10、加入500μl溶液V，12,000rpm离心1min，弃滤液；

A11、12,000rpm离心3min，以彻底去除纯化柱中残留的液体；

A12、将DNA纯化柱置于新的离心管中，向纯化柱中央处悬空滴加50-100μl溶液VI，室温放置2min；12,000rpm离心1min，管底即为高纯度质粒DNA。

用此试剂盒及方法提取出来的DNA纯度较高OD260/280在1.7-1.9之间，而用一般方法提取出来的DNA一般在1.6-2.0之间。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

实施例1试剂盒由溶液I-VI组成：

溶液I：50mM Tris-HCI和10mM EDTA，pH＝8.0(25℃)，50微克/毫升RNaseA；