[发明专利]可表达耐热β-半乳糖苷酶的重组菌及构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及应用微生物技术领域，具体涉及一种可表达耐热β-半乳糖苷酶的重组菌及构建方法和应用。

背景技术

β-半乳糖苷酶(EC3.2.1.23)学名为β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶，商品名为乳糖酶(lactase)， 该酶不仅能催化水解半乳糖苷键，将乳糖水解成为半乳糖和葡萄糖，同时具有转移半乳糖苷的作用，可以生成低聚半乳糖，主要用于乳制品的加工。

β-半乳糖苷酶主要来源于动物、植物、细菌、酵母、霉菌。国外已经商品化的β-半乳糖苷酶主要来源于大肠杆菌、黑曲霉、米曲霉、酵母、乳酸杆菌等。目前，仅来源与微生物的β-半乳糖苷酶具有工业应用价值。利用微生物发酵法制取β-半乳糖苷酶，酶源丰富，产量高，生产成本低，周期短，而且不受季节、地理位置等因素的影响。该酶可广泛应用于食品加工、医药、免疫、环境检测等各个领域。

世界上平均约70%-90%的成年人（尤其是非洲人和亚洲人）喝牛奶后因缺乏β-半乳糖苷酶不能降解牛奶中大量的乳糖而产生乳糖不耐受。而在低乳糖乳制品中，β-半乳糖苷酶能将乳糖水解为半乳糖和葡萄糖，可将乳糖含量降低70%-80%，可以减轻乳糖不耐受症状；还可以增加乳制品甜度，减少甜味剂的用量；防止乳制品的加工时结晶析出，影响产品质量；以牛乳或乳清中的乳糖为底物，经β-半乳糖苷酶催化可生成低聚半乳糖，低聚半乳糖的甜度为蔗糖的20%-40%，热稳定较好，在酸性条件下课作为双歧杆菌增殖因子，促进钙质吸收和有机酸生成、减低肠道pH、抑制外源菌生长和改善脂质代谢。β-半乳糖苷酶还可以用于酶免疫分析，具有无内源性干扰， 底物无致癌性和显色稳定的优点；β-半乳糖苷酶与荧光底物相结合可作超微量荧光酶联免；对微量激素、药物的定量分析，以及病毒、单克隆抗体等测定表明，乳糖酶具有灵敏的特点；乳清中含有乳糖，当乳清大量排放时会造成环境污染，用乳糖酶处理乳清，不但可生产食品添加剂（甜味剂、蛋白资源），易消化吸收的禽饲料和发酵原料（发酵生产酒精、乳酸、酶制剂等），而且还可解决乳清大量排放造成的环境污染问题。

一般而言，工业上所产生的酶大多数都反应温度较低，热稳定性不好，在乳制品生产应用中有一定局限性。而耐热β-半乳糖苷酶的热稳定性好，能在较高温度下作用，这样可以提高底物的浓度并能减少其它微生物的生产机会，对固定化酶很重要。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种可表达耐热β-半乳糖苷酶的重组菌，该重组菌能表达生产热稳定性β-半乳糖苷酶。

本发明还要解决的技术问题是提供上述重组菌的构建方法。

本发明最后解决的技术问题是提供上述重组菌在生产耐热β-半乳糖苷酶上的应用。

为了解决上述问题，本发明首先提供了一种可表达耐热β-半乳糖苷酶的重组菌，其分类命名为大肠埃希氏菌（Escherichia coli.）BL21-LA1，已于2011年7月27日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC No. 5097。

所述的可表达耐热β-半乳糖苷酶的重组菌的构建方法，包括以下步骤：用同样的限制性内切酶双酶切表达载体PGEX-4T-2和β-半乳糖苷酶基因后，将β-半乳糖苷酶基因克隆到表达载体PGEX-4T-2中，将其转化至大肠杆菌感受态细胞中，挑取阳性重组工程菌菌落，提取质粒，然后采用双酶切和测序的方法鉴定。

所述β-半乳糖苷酶基因来自嗜热厌氧菌群。

本发明还提供了一种利用所述的重组菌表达耐热β-半乳糖苷酶的方法，以IPTG为诱导剂培养重组菌BL21-LA1产酶，每100ml发酵液培养菌体生长至OD ₆₀₀达到0.8后，加入 IPTG， 使其终浓度达为1 m mol/L， 37℃振荡培养4-6 h，诱导重组蛋白获得表达。

本发明获得了一株可表达耐热β-半乳糖苷酶的重组菌，所述重组菌为大肠埃希氏菌（Escherichia coli.）BL21-LA1，已于2011年7月27日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，其简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No. 5097。该重组菌在含有100 mg/mL 氨苄青霉素的2×YT液体培养基中于37℃培养，经 IPTG诱导可获得目的蛋白的高效表达。经纯化处理得到的热稳定β-半乳糖苷酶对底物ONPG的降解表现出很高的效率。