[发明专利]一种新型连接酶反应介导的扩增方法及用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种扩增方法，尤其涉及一种连接酶反应介导的扩增方法。 

背景技术

核酸检测技术已被广泛应用于分子遗传学、免疫学、肿瘤学及微生物学等方面的临床诊断。随着分子生物学的飞速发展，一些新的核酸检测方法也不断涌现，其中，连接酶依赖的检测技术就是其中的一类。连接酶是一种封闭DNA或RNA 链上缺口(Nick)的酶，借助NAD⁺或ATP水解提供的能量催化2条核酸单链的3`端羟基和5`端磷酸基团反应形成磷酸二酯键。连接酶依赖的检测技术主要是通过核酸杂交原理及其在缺口连接处的保真性实现的。1988年，Landegren首先发明了连接酶体外突变检测技术OLA，并利用该技术鉴定了编码导致地中海镰刀型细胞贫血症的β球蛋白的突变等位基因β^S和野生型等位基因β^A之间的单碱基差异。1991年，Barany提取出耐热连接酶并发展了连接酶检测反应(Ligase detection reaction, LDR)和连接酶链式反应(Ligase chain reaction, LCR)技术。这两项技术的提出对连接酶依赖的体外检测技术的发展及应用具有深远的意义，但是都存在非特异信号干扰、易用性差等问题。其后，连接酶反应技术结合PCR技术, 衍生出了一系列新的检测技术。如LDR/PCR、MLPA、PLP(Padlock probe)、MIP(Molecular inversion probe)等，这些技术主要通过连接酶反应实现目的基因的“特异转化”，再由PCR系统扩增转化后的特异产物实现检测。该类技术都表现出较高的检测通量，甚至能够实现>10000重的基因分型（MIP技术），但是都存在非特异信号的干扰较严重，容易出现假阳性的问题。这类技术的非特异信号主要来源于：1.非特异连接酶反应；2.非特异的PCR扩增。LDR/PCR、MLPA技术由于受到这两种非特异的影响，故检测的灵敏度有限，且非特异信号能被检测出，存在假阳性的风险。PLP及MIP技术采用了外切酶消化未连接杂交探针的方法，在一定程度上消除了杂交探针在PCR反应中的非特异扩增，但是当检测重数较高时，仍然会受到非特异连接的影响，假阳性的出现仍不可避免。 

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提供一种克服连接酶反应及PCR的非特异信号干扰的扩增方法。该技术实现了降低反应背景、增强性噪比、避免假阳性等目的。

为解决上述问题，本发明提供一种新型连接酶反应介导的扩增方法，通过三条连接探针的连接酶反应实现下游的通用扩增及检测，其特征在于：每条连接探针由特异杂交序列及填入的标签序列组成，具体为：目标序列7从3’端到5’端分别分为A段，B段，C段和D段，连接探针a为A段的反向互补序列2加上一段上游引物标签序列1组成，即2－1； 连接探针b为C段的反向互补序列3’，加上B段和C段之间的检测标签序列4和B段的反向互补序列3组成，即3’-4-3； 连接探针c为一段下游引物结合标签序列6加上D段的反向互补序列5组成，即6－5；所述的序列1、4、6为不与目标序列杂交的序列。

所述的上游引物标签序列1、下游引物结合标签序列6和检测标签序列4的设计原则分别为：GC含量适中，Tm值为55-70℃，长度为18-35bp，与目标基因组无较高同源性。此处的无较高同源性是指同源性低于50%。

所述的序列2、3、3’、5为 GC含量适中，Tm值为50-70℃，与目标序列特异杂交。

所述的连接探针a、b和c的序列中除去序列1、4、6外均为特异杂交序列。。

本发明还提供一个试剂盒，包含上述的连接探针a、b和c，及试剂盒的用途。

本发明还提供一种芯片，包含上述的连接探针a、b和c，及芯片的用途。

所述目标序列的A、B、C和D段相互之间无间隔。

目标序列的GC含量适中，无重复序列或同源性较高的序列出现，连接探针特异杂交的位置最好不要有SNP或突变位点的出现，除非是SNP或突变检测实验中，SNP或突变位点最好位于连接探针的3’端。

本发明还涉及一种连接酶反应介导的扩增方法用途。

所述试剂盒、芯片和连接酶反应介导的扩增方法在进行基因序列分型、定量等检测中的用途。

本发明检测的是已知目标序列，可检测突变位点、SNP位点、各物种目标基因（如细菌及病毒的目标DNA）的定性及定量反应等。