[发明专利]一种丙酮酸磷酸双激酶重组表达菌株的构建方法及其应用

说明书

【技术领域】

本发明涉及微生物分子生物学和基因工程技术领域，涉及微生物蛋白质编码基因的克隆、表达载体的构建、重组表达菌株的构建、丙酮酸磷酸双激酶的表达、纯化及其应用。 

【背景技术】

丙酮酸磷酸双激酶(Pyruvate Phosphate Dikinase；EC 2.7.9.1)能可逆催化磷酸烯丙式丙酮酸、单磷酸腺苷(Adenosine Monophosphate；AMP)和焦磷酸盐(Pyrophosphate；PPi)生成三磷酸腺苷(Adenosine Triphosphate，ATP)、无机磷酸盐(Orthophosphate)和丙酮酸。因此，该酶在ATP-荧光素-荧光素酶生物发光体系中能够持续催化AMP生成ATP，对于体系形成稳态生物发光信号、简化检测过程中发光信号的测定具有积极意义。 

在实际应用中，该酶可用于ATP发光法快速检测食品中的细菌数量。邹秉杰等对热玫瑰小双孢菌来源的丙酮酸磷酸双激酶进行了基因克隆、表达等研究，并将所得到的酶与荧光素酶偶联，应用于ATP-AMP的催化循环反应(邹秉杰，陈颖，马寅姣，周国华.重组丙酮酸磷酸双激酶与荧光素酶偶联催化ATP-AMP循环反应[J].中国生物化学与分子生物学报，2008，24(11)：1081～1084.)。 

本发明采用天蓝色链酶菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)株作为出发菌 株，对该菌株染色体DNA所编码的丙酮酸磷酸双激酶基因进行了克隆，构建了重组表达载体和重组表达菌株，并对重组表达菌株进行了诱导表达，在ATP-荧光素-荧光素酶生物发光体系中对该酶的活性进行了检验，结果提示天蓝色链酶菌A3(2)株来源的丙酮酸磷酸双激酶具有很高的酶活力，在微生物的生物发光法检测中有很重要的应用价值。 

【发明内容】

[要解决的技术问题] 

本发明的目的是构建一种适合于在大肠杆菌中表达天蓝色链酶菌A3(2)株来源的丙酮酸磷酸双激酶的重组表达菌株，并提供该重组表达菌株诱导表达丙酮酸磷酸双激酶的方法、丙酮酸磷酸双激酶的的纯化方法以及该酶的应用举例。因而本发明要解决的技术问题就是：构建丙酮酸磷酸双激酶表达载体和重组表达菌株所需的材料和方法，以及丙酮酸磷酸双激酶的诱导表达和纯化所需的材料和方法，以及进行ATP转化的实际应用所需的材料和方法。 

[技术方案] 

本发明采用来源于天蓝色链霉菌的丙酮酸磷酸双激酶，构建一种适合该酶进行诱导表达的表达载体，构建适合该酶进行诱导表达的重组表达菌株，并采用上述构建的重组表达菌株进行丙酮酸磷酸双激酶的诱导表达，然后对该丙酮酸磷酸双激酶进行纯化和酶活性检测。 

本发明采用的宿主菌株为大肠杆菌BL21(DE3)，以市售的商品化大肠杆菌表达载体pET28a(+)作为本发明中诱导表达载体构建的基本骨架，以天蓝 色链霉菌A(3)2基因组DNA为模板，通过聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction；简称PCR)扩增出丙酮酸磷酸双激酶的编码基因ppdk、构建重组表达载体pET28a-ppdk，并将该重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组表达菌株BL21(DE3)/pET28a-ppdk。 

重组表达菌株BL21(DE3)/pET28a-ppdk在含有50μg/mL卡那霉素的Luria-Bertani(LB)液体培养基中进行培养，随后采用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行丙酮酸磷酸双激酶的诱导表达，收获诱导表达后的发酵菌体，进行超声波破碎处理，对细胞破碎液进行离心并收获含有丙酮酸磷酸双激酶的上清液，表达结果通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)来显示和分析。采用亲和层析方法对该酶进行纯化处理，纯化得到的样品通过SDS-PAGE来显示和分析。采用ATP-荧光素-荧光素酶生物发光体系对纯化得到的丙酮酸磷酸双激酶进行酶活力检测和评估。 

[具体实施方式] 

(1)丙酮酸磷酸双激酶编码基因的克隆：首先以天蓝色链霉菌A3(2)株基因组DNA为模板，采用引物P1和P2(见表1)进行PCR扩增得到ppdk基因片段，对该片段进行DNA序列测定以验证其正确性。测序正确后用于下一步实验。