[发明专利]一种丙酮酸磷酸双激酶重组表达菌株的构建方法及其应用

权利要求书

1.一种表达生产丙酮酸磷酸双激酶的重组大肠杆菌(Escherichia coli)菌株BL21(DE3)/pET28a-ppdk的构建方法及其应用。该菌株已于2012年1月4日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京)保藏，其保藏编号为CGMCC 5691。

2.根据权利要求1所述的大肠杆菌菌株BL21(DE3)/pET28a-ppdk及其应用，其特征在于该菌株的构建方法如下：

(1)丙酮酸磷酸双激酶编码基因的克隆

以天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)株基因组DNA为模板，采用引物P1和P2进行聚合酶链式反应(PCR)，扩增得到丙酮酸磷酸双激酶的编码基因ppdk(Gene ID：1095632)，该基因长约2.7kb，带有6个组氨酸标签(His-Tag)。

(2)表达载体和重组菌株的构建

将该基因ppdk用限制性内切酶NdeI和XhoI进行降解，回收NdeI-XhoI片段并克隆到表达载体pET28a(+)中的NdeI-XhoI位点，得到重组表达质粒pET28a-ppdk，将该载体转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)，得到重组菌株大肠杆菌菌株BL21(DE3)/pET28a-ppdk。

3.根据权利要求1所述的大肠杆菌菌株BL21(DE3)/pET28a-ppdk及其应用，其特征在于丙酮酸磷酸双激酶的诱导表达和分离纯化方法如下：

将大肠杆菌菌株BL21(DE3)/pET28a-ppdk于添加了卡那霉素(终浓度为50μg/mL)的Luria-Bertani培养基液体(简称LB培养基)中培养，当培养液浊度OD600达到0.6～0.8之间时，采用终浓度为0.05～1.0mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)作为诱导剂，于20℃～37℃之间进行诱导培养2～10小时。

4.根据权利要求1所述的大肠杆菌菌株BL21(DE3)/pET28a-ppdk及其应用，其特征在于丙酮酸磷酸双激酶诱导表达产物的分离纯化方法如下：

回收发酵液菌体并采用超声波破除细胞壁，将得到的上清液经过镍螯合琼脂糖凝胶亲和介质填充层析柱，对重组的丙酮酸磷酸双激酶进行分离纯化。

5.根据权利要求1所述的大肠杆菌菌株BL21(DE3)/pET28a-ppdk及其应用，其特征在于扩增丙酮酸磷酸双激酶编码基因ppdk的引物序列如下：

-P1.5′-GTCTATCATATGGCCCGTTACGTGTACGAC-3′ 

P2：5′-TATATACTCGAGTCGGCTGTCGCCGGCATCG-3′ 。