[发明专利]一种蚯蚓提取物及其提取方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种以蚯蚓成虫为原料提取具有很强生物活性的蚯蚓多肽，同时还涉及该蚯蚓多肽的提取方法和该蚯蚓多肽的应用，属于生物化学技术领域。

背景技术

帕金森病(Parkinson′s disease，PD)是一种中老年常见的神经系统退行性疾病，以黑质多巴胺(dopamine，DA)能神经元缺失和Lewy小体形成为其主要病理特征。随着我国人口老龄化进程的加快，PD发病率日益增高。目前绝大多数PD患者以药物治疗为主，虽能改善临床症状，但长期应用会出现“开-关”现象、运动及精神障碍等副作用，且仍无法延缓DA能神经元进行性变性。近年来药物治疗的研究由直接补充DA转向多环节作用，研究重点集中于对DA能神经元的保护作用及减少多巴制剂毒副作用上，但其临床效果尚不令人满意。因此，针对PD发病机制，研发疗效明确且毒副作用少的药物，已成为当今老年医学领域研究的热点之一。

蚯蚓在我国入药已有几千年的历史，中药俗称为地龙，性寒，味咸，具有清热定惊、通络、平喘、利尿之功效，是我国重要的中药材之一。最早的中药学专著《神农本草经》中收载的67种动物药中就有蚯蚓。《本草纲目》中用蚯蚓入药的处方有40多种。《中药大辞典》中记载用蚯蚓配方治疗各种疾病者达30多处。现代药理学研究表明，蚯蚓具有多方面的药理学活性：具有抗凝血、溶血栓的双重作用、降压作用、免疫增强作用、杀灭精子、强化精子的双向作用、抗癌作用、解热、抗脑缺血、平喘、抗菌、抗氧化、促进创伤修复和细胞再生等作用。其中以纤溶酶的研究最多，取得较大进展，其他有效部位及成分尚不十分明确。作为一种常用动物药材，其化学成分种类繁多，结构复杂，大多为高分子有机化合物，虽然由于其药理活性显著，资源丰富，已经被广泛应用，但在化学成分、药理等方面的基础研究相对薄弱，大大限制了其在临床上的深入应用，而蚯蚓多肽作为一种天然来源的活性肽具有分子量小、制备相对容易、纯度高、抗原性弱、功能较明确、特异性强、毒副作用小、易于多途径吸收等大分子蛋白不可比拟的优点。目前，有关蚯蚓多肽的提取方法及具体药理作用研究尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种蚯蚓提取物。

同时，本发明的目的还在于提供了一种蚯蚓提取物的提取方法。

进一步地，本发明的目的还在于提供了一种该蚯蚓提取物在构建对帕金森病离体细胞模型保护方面的应用。

为了实现上述目的，本发明的技术方案采用了一种蚯蚓提取物，由以下方法提取获得：(1)粗多肽的制备：新鲜冰冻蚯蚓(赤子爱胜蚯蚓，Eisenia foetida)1kg，切成小段，用预先冷却的蒸馏水(3-5℃)冲洗，至完全无血色为止；绞肉机绞成肉泥，加入预冷的匀浆液(pH为4的甘氨酸水溶液5000ml)用胶体磨反复匀浆；所得匀浆液离心(4℃，5500rpm，10min)，取上清，加入95％乙醇使其终浓度达到60％，4℃放置并搅拌，4h后离心(4℃，5500rpm，15min)，取上清；所得上清真空旋转蒸发(55℃)回收乙醇至浓缩液体积为500ml；浓缩液冷冻干燥，得到蚯蚓多肽粗提物，-20℃保存为冻干品待用；以上操作除回收乙醇外均应在低温4℃条件下进行；

(2)粗多肽的脱盐纯化：取上述冻干品2.5g，用10ml蒸馏水溶解，以Sephadex G-25为介质装填层析柱(柱规格：φ35mm×30cm)，层析柱用蒸馏水充分平衡，将样品加入柱内，用蒸馏水洗脱，流速为2.5ml/min，至出峰时起用自动馏分收集器收集，每管10ml；采用电导率仪测定各管的电导率，将峰前部分收集，冻干得冻干品即为蚯蚓多肽。

步骤(2)得到的冻干品在-20℃保存。

本发明的技术方案还在于采用了一种蚯蚓提取物的提取方法，包括以下步骤：(1)粗多肽的制备：新鲜冰冻蚯蚓(赤子爱胜蚯蚓，Eisenia foetida)1kg，切成小段，用预先冷却的蒸馏水(3-5℃)冲洗，至完全无血色为止；绞肉机绞成肉泥，加入预冷的匀浆液(pH为4的甘氨酸水溶液5000ml)用胶体磨反复匀浆；所得匀浆液离心(4℃，5500rpm，10min)，取上清，加入95％乙醇使其终浓度达到60％，4℃放置并搅拌，4h后离心(4℃，5500rpm，15min)，取上清；所得上清真空旋转蒸发(55℃)回收乙醇至浓缩液体积为500ml；浓缩液冷冻干燥，得到蚯蚓多肽粗提物，-20℃保存为冻干品待用；以上操作除回收乙醇外均应在低温4℃条件下进行；