[发明专利]一种产乙偶姻菌株的筛选方法及用该菌株发酵法生产乙偶姻

说明书

技术领域

一种产乙偶姻菌株的筛选方法及应用该菌株生产乙偶姻，属于生物工程领域。

背景技术

3-羟基丁酮(3-hydroxybutanone)又名乙偶姻，具有令人愉快的香味，可作为一种食用香料广泛应用在食品生产中，如用于奶油、咖啡的香味增强剂及配制乳品、草莓型香精等，也可作为微生物合成重要化工原料和液体燃料的2，3-丁二醇及双乙酰的前体物质。此外，3-羟基丁酮还可作为一种平台化合物，广泛应用于其他众多行业，2004年美国能源部将其列为30种优先开发利用的平台化合物之一。因此，3-羟基丁酮作为一种重要的化学合成中间体和多功能材料，广泛应用于食品、制药、化工等领域。其生产方法有：化学合成法、酶转化法和微生物发酵法。其中，化学合成法已实现工业化生产，该法操作简单易行，但污染重、成本高、原料受石油制约、产品质量难以达到食用香料的要求。微生物发酵法具有生产成本低廉、对环境友好、产品纯度高、反应条件温和等优势，能解决化学合成法和酶转化法所面临的环境、资源、产品质量等问题受到越来越多的关注。

发明内容

本发明的目的是提供一种乙偶姻生产菌及其筛选方法和用该菌株发酵法生产乙偶姻。

本发明的技术方案：

1、一种产乙偶姻菌株的筛选方法：

从制酒作坊附近的土壤取土样，称取约5.0g，在80℃的烘箱中烘烤48h，加入到200ml的无菌水中制成悬液。此菌悬液作为母液梯度稀释至10^-6，取10^-4-10^-6稀释菌液涂布于富集培养基上，37℃倒置培养24h，挑取不同菌落形态的单菌落进行V-P实验考察，将V-P阳性菌株逐一转接发酵培养基，并进行编号保存；培养结束后各取2mL，10000r/min离心10min，用HPLC法检测上清液中的乙偶姻含量，筛选出十几株产乙偶姻的菌株，其中菌株FMME044产乙偶姻的能力最强。

2、根据权利要求1所述一种产乙偶姻菌株的筛选方法，其筛选得到产乙偶姻菌株的鉴定方法如下：

1)生理生化鉴定

接触酶试验，V.P.及M.R.试验，明胶液化及淀粉水解，耐盐试验，硝酸盐还原试验；

2)16S rDNA分子生物学鉴定

用细菌基因组提取试剂盒提取细菌基因组DNA，采用枯草芽孢杆菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增，扩增产物用胶回收试剂盒回收纯化，并连接至克隆载体pMD 18 T Vector，转化到大肠杆菌JM109中，利用克隆载体的青霉素抗性筛选到阳性转化子，并用通用引物对转化子进行质粒PCR鉴定。

阳性克隆测序所得16S rDNA序列与GenBank数据库中的核苷酸序列进行同源性分析，得到与之亲缘关系最近的菌种Bacillus amyloliquifaciens，同源性达99％。

通过生理生化及16S rDNA分子生物学鉴定确定该菌株为解淀粉芽孢杆菌，并命名为Bacillus amyloliquifaciens FMME044。

3、本发明公开的一种乙偶姻的生产方法，其特征是采用Bacillus amyloliquifaciens FMME044为出发菌株，以种子培养和液体发酵生产乙偶姻；

1)种子培养：

种子培养基以g/L计：葡萄糖10，牛肉膏5，蛋白胨5，初始pH 7.0；

培养条件：温度37℃、摇床转速200rpm条件下，培养10-12h；

2)液体发酵培养：

发酵培养基以g/L计：葡萄糖120，蛋白胨10，酵母粉10，NaCl 5，K₂HPO₄ 3，MgSO₄ 0.4，初始pH 7.0；

发酵条件：接种量10％(v/v)，温度37℃、摇床转速200rpm条件下，发酵60-72h。

3)7L发酵罐发酵培养：

发酵培养基以g/L计：葡萄糖120，蛋白胨10，酵母粉10，NaCl 5，K₂HPO₄ 3，MgSO₄ 0.4，初始pH 7.0；

7L发酵罐中发酵培养基装液量为4L，接种量10％(v/v)，温度为37℃，搅拌转速为400r/min，通气量为1.0vvm，过程中不控制pH，培养时间32-48h。

4、乙偶姻产量的测定