[发明专利]一种猪捷申病毒的体外分离方法

说明书

技术领域

本发明属于兽医生物技术领域，具体涉及一种猪捷申病毒的体外分离方法。

背景技术

猪传染性脑脊髓炎，又称猪捷申病是由猪捷申病毒(Porcine Teschovirus，PTV)引起的，可以引起猪腹泻、呼吸道症状、猪脑脊髓灰质炎、繁殖障碍、肺炎、下痢、心包炎和心肌炎、皮肤损伤等多种表现的一种病毒性传染病，严重危害养猪业。

猪捷申病毒，原属于小RNA科，肠道病毒属，1999年病毒分类学委员会将肠道病毒属猪肠道病毒中的11个血清型列为捷申病毒属。由于临床上一般猪捷申病毒都是与其他病毒混合感染猪群，并且捷申病毒与临床常见的猪病病毒一样，都可以在IBRS-2细胞、PK-15细胞、ST细胞等猪肾传代细胞系上生长，并且产生的细胞病变也不是特别典型，因此给猪捷申病毒分离与纯化带来一定困难。

噬斑纯化是用细胞分离病毒的常见的纯化方法，是利用某些病毒可以在细胞上形成肉眼可见的病变的特点，利用低熔点琼脂糖固定使得病变的病毒可以逐个挑出，一般认为一个噬斑就是一个病毒，一般经过三轮噬斑纯化，就可以得到较为纯净的病毒，这种病毒经过检测可以作为科研与疫苗制备中的种毒使用。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供一种猪捷申病毒的体外分离方法。

本发明的一种猪捷申病毒的体外分离方法，其包括如下步骤：

1)从临床上诊断为疑似猪捷申病毒感染的猪病料中获取用nRT-PCR鉴定为阳性，并进行过滤除菌的病料上清液；

2)用步骤1)获得的病料上清液感染猪肾传代细胞系，连续传代培养至90％以上的细胞出现病变，其中，每代在收毒时均取上清进行nRT-PCR检测，保留PCR阳性的病毒液继续传代；

3)将步骤2)传代培养后的猪捷申病毒用噬斑纯化方法进行纯化。

在本发明一个优选的实施方案中，其中步骤1)具体包括如下步骤：

用细胞培养液研磨所述的猪病料，反复冻融2～4次，8000～12000rpm冷冻离心5～30min，取上清液进行总RNA的提取，进行nRT-PCR扩增，检测为阳性的病料上清液用0.22μm的过滤器进行过滤除菌。

其中，细胞培养液和猪病料的液固比为1～10∶0.5～10(ml∶g)。

在本发明另一个优选的实施方案中，步骤3)具体包括如下步骤：

将猪肾传代细胞系培养成单层细胞，将步骤2)获得的病毒液进行10倍倍比稀释0～9次后，以0.01～0.2ml/cm²细胞的量接种细胞，摇匀后置37℃感作30min～2h，吸弃病毒液，用减血清培养基Opti-MEM以0.1～0.3mL/cm²细胞的量，洗涤1～2次后，将37℃含2％～6％胎牛血清的2×DMEM与60℃低熔点琼脂糖均匀混合后铺于细胞上，厚度为2～4mm，在37℃、5％CO₂培养箱中培养，72h后挑选单个噬斑，接种于所述的猪肾传代细胞系上扩大培养，经三轮噬斑纯化后，将最后一次挑取的噬斑接种于所述的猪肾传代细胞系扩大培养，经鉴定后作为纯化的病毒。

其中，所述的病料优选为肺脏、肠和/或脑组织，更优选为小脑组织。

其中，所述的猪肾传代细胞系优选为IBRS-2、PK-15或ST细胞系，更优选为PK-15细胞系。

其中，步骤2)中连续传代培养的代数优选为5～10代。

本发明的方法是以临床收集的样本，经巢式反转录聚合酶链式反应(nRT-PCR)检测为猪捷申病毒阳性，通过研磨、离心、过滤等处理后，用体外传代细胞系猪肾传代细胞系进行分离培养，并用噬斑试验进行纯化，以及通过nRT-PCR和免疫荧光方法鉴定为纯化的PTV病毒。该分离纯化方法特异性高、敏感性强，能快速、特异地分离纯化猪捷申病毒。

附图说明

图1所示nRT-PCR检测结果。其中，从左至右依次为DL2000DNA Marker、第一轮PCR阳性目的条带(321bp)、第二轮PCR阳性目的条带(158bp)、阴性目的条带对照。

图2所示为猪捷申病毒在PK-15上的CPE(×100)。

图3所示为正常无病变的PK-15细胞(×100)。

图4所示为猪捷申病毒荧光鉴定照片(×200)。

图5所示为荧光阴性对照照片(×200)。

图6所示为猪捷申病毒噬斑纯化图片。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。