[发明专利]一种猪捷申病毒的体外分离方法

权利要求书

1.一种猪捷申病毒的体外分离方法，其包括如下步骤：

1)从临床上诊断为疑似猪捷申病毒感染的猪病料中获取用nRT-PCR鉴定为阳性，并进行过滤除菌的病料上清液；

2)用步骤1)获得的病料上清液感染猪肾传代细胞系，连续传代培养至90％以上的细胞出现病变，其中，每代在收毒时均取上清进行nRT-PCR检测，保留PCR阳性的病毒液继续传代；

3)将步骤2)传代培养后的猪捷申病毒用噬斑纯化方法进行纯化。

2.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，其中步骤1)具体包括如下步骤：

用细胞培养液研磨所述的猪病料，反复冻融2～4次，8000～12000rpm冷冻离心5～30min，取上清液进行总RNA的提取，进行nRT-PCR扩增，检测为阳性的病料上清液用0.22μm的过滤器进行过滤除菌。

3.根据权利要求2所述的分离方法，其特征在于，其中，细胞培养液和猪病料的液固比为1～10∶0.5～10。

4.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，其中步骤3)具体包括如下步骤：

将猪肾传代细胞系培养成单层细胞，将步骤2)获得的病毒液进行10倍倍比稀释0～9次后，以0.01～0.2ml/cm²细胞的量接种细胞，摇匀后置37℃感作30min～2h，吸弃病毒液，用减血清培养基Opti-MEM以0.1～0.3mL/cm²细胞的量，洗涤1～2次后，将37℃含2％～6％胎牛血清的2×DMEM与60℃低熔点琼脂糖均匀混合后铺于细胞上，厚度为2～4mm，在37℃、5％CO₂培养箱中培养，72h后挑选单个噬斑，接种于所述的猪肾传代细胞系上扩大培养，经三轮噬斑纯化后，将最后一次挑取的噬斑接种于所述的猪肾传代细胞系扩大培养，经鉴定后作为纯化的病毒。

5.根据权利要求1～4任一项所述的分离方法，其特征在于，其中步骤1)中所述的病料为肺脏、肠和/或脑组织。

6.根据权利要求1～4任一项所述的分离方法，其特征在于，所述的猪肾传代细胞系为IBRS-2、PK-15或ST细胞系。

7.根据权利要求1～4任一项所述的分离方法，其特征在于，其中步骤2)中连续传代培养的代数为5～10代。