[发明专利]一种柔嫩艾美耳球虫蛋白磷酸酶基因及其表达方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella，E.tenella)蛋白磷酸酶基因及其表达方法和应用，属于生物技术领域。 

背景技术

鸡球虫病是由顶复器门，艾美耳属细胞内原虫寄生感染的，在养禽业中最常见、最有害、最致命、经济损伤最严重的一种原虫病。该病往往呈急性暴发，引起鸡下痢、便血、贫血，以致大批死亡；慢性病例则导致鸡群食欲减退、生长发育受阻、贫血、影响增重并降低饲料转化率。该病以3月龄以内的鸡最易感，雏鸡的发病率和死亡率均较高。病愈的雏鸡生长受阻，增重缓慢，常常容易引起大肠杆菌等条件性致病菌而发病，使鸡群出现产蛋能力降低、顽固性拉稀、免疫抑制，抗病力降低等症状。成年鸡多为带虫者，尽管没有明显症状，但对生长性能和产蛋能力都产生了很大影响，给养鸡业带来了巨大的经济损失。另外，球虫以其生命周期短，环境适应性强，传播能力大等特点，是目前危害养禽业的最顽固的病原体，防不胜防，给养禽业带来的巨大的经济损失。尤其是第二代裂殖生殖阶段，产生的大量的裂殖子重新入侵未感染的肠道上皮细胞，导致肠粘膜出现了扁平样结构，肠绒毛萎缩，大面积的坏死和糜烂塌陷，阻碍了营养物质的吸收，使感染鸡群排出血便，消化和吸收功能下降，饲料转化率降低，鸡增重下降，诱发其他病原感染而死亡，严重的影响了养鸡业的发展。 

药物防治仍然是目前防治球虫病的主要手段，而针对耐药性的产生，迫切需要抗球虫新药的研发，而新药的研发需要寻找重要的作用靶标，一般主要通过筛选来得到抑制剂，或者通过设计抑制分子去探测靶蛋白的特性。然而药物靶位的筛选是一个漫长的过程。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种柔嫩艾美耳球虫蛋白磷酸酶基因。 

本发明的目的还在于提供一种柔嫩艾美耳球虫蛋白磷酸酶基因在制备抗鸡球虫病药物物的应用。 

为了实现上述目的，本发明的技术方案采用了一种柔嫩艾美耳球虫蛋白磷酸酶基因，具有编码SEQ ID NO.1的氨基酸序列。 

所述的基因全长2562bp，含有完整的1647bp ORF，编码549个氨基酸，理论分子量为60822.4Da，分子式为C₂₇₀₅H₄₂₃₅N₇₃₉O₈₀₃S₂₇，等电点为5.89，带负电荷的氨基酸总数(Asp+Glu)为71个，带正电荷的氨基酸总数(Arg+Lys)为62个，总体偏酸性，抗原位点分析发现有19个抗原位点。 

本发明的技术方案还采用了一种柔嫩艾美耳球虫蛋白磷酸酶基因的表达方法，包括以下步骤：以E.tenella为实验虫株，建立了药物抗球虫作用模型，以E.tenella第二代裂殖子为研究对象，构建了地克珠利作用E.tenella第二代裂殖子差异表达cDNA消减文库，借 助cDNA微阵列技术筛选出一种地克珠利抗球虫作用的关键分子，经BlastP比对分析表明为E.tenella丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶(EtPP)EST序列。 

所述的表达方法具体包括以下步骤： 

(一)E.tenella第二代裂殖子的制备 

(1)试验模型的建立 

优质黄羽蛋公雏购自洛阳市光华种鸡场，在河南科技大学试验动物房进行饲养，饲养环境保持清洁卫生，且无任何病原体污染。实验动物饲养至12日龄时，平均分为两组，实验14日龄，两种均接种球虫，分为感染对照组(接种球虫，0mg/kg地克珠利饲料)和药物处理组(接种球虫，1mg/kg地克珠利饲料，从实验96h到实验120h)。建立地克珠利抗球虫试验动物模型； 

(2)E.tenella第二代裂殖子的制备 

在感染后120h扑杀试验鸡，剪开盲肠壁，去除盲肠内容物，用含双抗冰冷的PBS洗去盲肠上残余的内容物；将洗净的盲肠在培养皿中剪成约1cm³大小的碎块，转移至烧杯中，加入10倍体积的酶消化液，37℃水浴中消化45min，并不时的搅拌，使裂殖子充分游离出来；并经四层灭菌纱布过滤，除去大的组织块和杂质；滤液经3000r/min离心10min；用PBS重悬沉淀，洗涤，3000r/min离心10min；采用红细胞裂解液重悬沉淀，4℃裂解10min，并不时的搅动，然后2500r/min离心10min；用PBS洗涤沉淀一次，3000r/min离心10min；