[发明专利]一种柔嫩艾美耳球虫蛋白磷酸酶基因及其表达方法和应用

权利要求书

1.一种柔嫩艾美耳球虫蛋白磷酸酶基因，其特征在于：具有编码SEQ ID NO.1的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的柔嫩艾美耳球虫蛋白磷酸酶基因，其特征在于：所述的基因全长2562bp，含有完整的1647bp ORF，编码549个氨基酸，理论分子量为60822.4Da，分子式为C₂₇₀₅H₄₂₃₅N₇₃₉O₈₀₃S₂₇，等电点为5.89，带负电荷的氨基酸总数(Asp+Glu)为71个，带正电荷的氨基酸总数(Arg+Lys)为62个，总体偏酸性。抗原位点分析发现有19个可能的抗原位点。

3.一种柔嫩艾美耳球虫蛋白磷酸酶基因的表达方法，其特征在于：包括以下步骤：以E.tenella为实验虫株，建立了药物抗球虫作用模型，以E.tenella第二代裂殖子为研究对象，构建了地克珠利作用E.tenella第二代裂殖子差异表达cDNA消减文库，借助cDNA微阵列技术筛选出一种地克珠利抗球虫作用的关键分子，经BlastP比对分析表明为E.tenella丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶(EtPP)EST序列。

4.根据权利要求1所述的柔嫩艾美耳球虫蛋白磷酸酶基因的表达方法，其特征在于：所述的表达方法具体包括以下步骤：

(一)E.tenella第二代裂殖子的制备

(1)试验模型的建立

优质黄羽蛋公雏，实验动物饲养至12日龄时，平均分为两组，实验14日龄，两种均接种球虫，分为感染对照组(接种球虫，0mg/kg地克珠利饲料)和药物处理组(接种球虫，1mg/kg地克珠利饲料，从实验96h到实验120h)，建立地克珠利抗球虫试验动物模型；

(2)E.tenella第二代裂殖子的制备

在感染后120h扑杀试验鸡，剪开盲肠壁，去除盲肠内容物，用含双抗冰冷的PBS洗去盲肠上残余的内容物；将洗净的盲肠在培养皿中剪成约1cm³大小的碎块，转移至烧杯中，加入10倍体积的酶消化液，37℃水浴中消化45min，并不时的搅拌，使裂殖子充分游离出来；并经四层灭菌纱布过滤，除去大的组织块和杂质；滤液经3000r/min离心10min；用PBS重悬沉淀，洗涤，3000r/min离心10min；采用红细胞裂解液重悬沉淀，4℃裂解10min，并不时的搅动，然后2500r/min离心10min；用PBS洗涤沉淀一次，3000r/min离心10min；

用PBS将沉淀稀释，加入Percoll分离液，配置成30％Percoll悬液；将含30％Percoll的裂殖子悬液缓慢加至50％的Percoll PBS溶液上面，注意不要破坏液面；3200r/min离心15min后，小心吸取50％的Percoll溶液层到另一干净的离心管中；用PBS清洗含裂殖子吸出液，3500r/min离心5min后，收集沉淀；PBS洗涤，3500r/min离心5min，沉淀即为获得的第二代裂殖子；

(二)E.tenella第二代裂殖子EtPP基因的克隆

(1)E.tenella第二代裂殖子总RNA的提取

总RNA的提取按照Invitrogen公司的Trizol试剂提取操作说明进行；

(2)E.tenella第二代裂殖子EtPP基因5’和3’的扩增

以消减文库中筛选测序后的序列为EST，以按照clonetech公司SMARTer^TM RACE cDNAAmplification Kit说明书进行基因3’和5’的扩增，

5’RACE 3’primer：为5’-GACAGTTTGCGTGCGTCCGTTGAAG-3’，

3’RACE 5’primer为5’-CCGTCTGCTACCCCTGGCTTTTGTG-3’，扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分析；

(3)E.tenella第二代裂殖子EtPP基因5’和3’PCR扩增产物的回收及与测序

采用QIAGEN公司的QIA quick Gel Extraction kit回收基因5’和3’的扩增产物，并与pMD19-T Vector连接，转化转化DH5α感受态细胞，进行蓝白斑筛选，挑选白斑菌落过夜培养后，进行PCR鉴定；

(4)E.tenella第二代裂殖子EtPP基因全长序列的拼接

将测序获得的3’RACE和5’RACE PCR产物序列，利用DNAstar软件查找扩增产物的序列与原EST序列的重叠部分，将三段序列拼接为全长cDNA序列；

(5)E.tenella第二代裂殖子EtPP基因的扩增与测序

以拼接全长基因序列为基础，利用Primer 5.0软件设计上下游引物，以cDNA为模板，全长扩增引物为：Sense primer：5′-TGCATGCGACAGGATATTTG-3′和Antisense primer：5′-GCGAAGTTTTCAATGCCAAG-3′，进行RT-PCR扩增全长；反应结束后采用QIAGEN公司的QIA quick Gel Extraction kit将PCR产物与pMD19-T Vector连接，转化DH5α感受态细胞，进行蓝白斑筛选，挑选白斑菌落过夜培养后，进行PCR鉴定；

(三)E.tenella第二代裂殖子EtPP蛋白的表达

(1)EtPP表达质粒的构建

以cDNA为模板，根据测序获得序列及表达载体pET-28a多克隆位点，在目的序列ORF两端选择EcoR I和Not I酶切位点，

引物序列为：Sense primer：5′-CTAGAATTCATGGCGGAAGGCAGCGAC-3′和Antisense primer：5′-GCAGCGGCCGCTTAAATGAAGCTTAGC-3′，利用PCR扩增EtPP基因，对PCR回收产物和pET-28a质粒分别用EcoR I和Not I进行双酶切，纯化回收后，T4DNA连接酶连接，并转化大肠杆菌DH5α细胞，挑取单克隆，PCR及测序证明EtPP基因已正确插入HIS基因的下游，命名为pET-28a-EtPP；

(2)EtPP表达质粒在大肠杆菌中的表达

将鉴定正确的重组表达质粒pET-28a-EtPP转入大肠杆菌BL21(DE3)宿主细胞，37℃过夜培养，挑取单菌落，接种于含Kan的LB液体培养基中扩大培养，当菌液在37℃培养至OD260大约0.4～0.6时，加入IPTG至终浓度为0.8mmol/L，37℃诱导表达，在不同的培养时间收集菌体，超声破碎后，进行SDS-PAGE电泳分析，表达产物主要以包涵体形式存在；

(3)EtPP蛋白的纯化

BL21(DE3)表达的EtPP蛋白主要以包涵体的形式存在。取上述菌体，12000r/min，4℃离心15min后取沉淀，PBS洗涤并重悬菌体，冰浴超声后，12000r/min，4℃离心后收集沉淀，即得纯净的包涵体；然后参照His·Bind树脂纯化法纯化包涵体蛋白，SDS-PAGE进行检测分析。

5.一种利用柔嫩艾美耳球虫蛋白磷酸酶基因制备抗鸡球虫病药物的应用。