[发明专利]一种检测体液细胞中结核杆菌特异性分泌抗原的免疫细胞化学染色试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测体液细胞结核杆菌早期分泌抗原靶ESAT6的免疫细胞化学染色试剂盒。

背景技术

结核病是由结核分枝杆菌(MTB)引起的人兽共患慢性传染病，是威胁人类的三大传染性疾病之一，目前全世界大约有20亿人感染结核分枝杆菌，每年大约有200-300万人死于结核。加之多重耐药结核菌的流行、人类免疫缺陷病毒的感染及贫穷等多种因素的影响，结核病发病率呈日益回升的严重趋势，结核性脑膜炎（TBM）的发病率亦逐渐升高。结核性脑膜炎是严重的中枢神经系统感染性疾病，病死率和病残率均较高。因此，早期、快速、有效的病原学诊断对及时治疗结核性脑膜炎、减少病死率和后遗症极其重要。

目前常用的结核分支杆菌感染的检测方法包括：

脑脊液抗酸杆菌涂片法具有简便、快速、价廉的优点，但阳性率低，约10%，且需要检材中的细菌≥10⁴/ml 才能找到，特异性差，各种抗酸杆菌均可着色，需要通过进一步的试验才能确定是否为结核分支杆菌，无法区分死菌和活菌。

结核分枝杆菌培养检查，培养时间较长，需4～8周，且阳性率低，多在20～30%，对临床早期诊断价值有限。

分子生物学具有敏感、快速、特异、高效等优点，但在大批量临床应用中，PCR作为一种诊断手段仍然存在一定的假阳性和假阴性，污染、扩增循环过多或退火温度过低而引起非特异性扩增产物从而产生假阳性，需要相应的检测设备且检测费用高。

结核菌素皮肤试验（TST）是建立在机体对PPD迟发性超敏反应的基础上，但PPD是将结核分支杆菌培养物加热灭活和沉淀制成的一组蛋白质，为成分不明确的复合抗原，其许多成分与卡介苗和非结核分枝杆菌的抗原成分相同，因此，在卡介苗接种率和非结核分枝杆菌感染率较高的地区，TST方法的特异度较低。对于免疫低下者、近期感染者、年幼儿童及营养不良者，TST方法缺乏足够的灵敏度。另外，TST方法缺乏一个内在固有数值来判定一个人是否存在结核杆菌的感染，该方法以某数值为界来判断某人是否存在结核杆菌潜伏感染，不同的界值可能会对个体的划分产生错误，影响方法的灵敏度和特异度。

生化检查方法具有重要的诊断价值，但患者多数入院前已经过抗菌、抗病毒、抗痨甚至激素等治疗，使脑脊液呈不典型改变。

结核抗体测定是结核病研究和应用报道最多的方法。MTB患者的脑脊液中抗MTB IgG抗体高于其自身血液中特异性IgG抗体，说明中枢神经系统能局部合成抗体，经受损血脑屏障转送到CSF中。综合多家报道，结核抗体检测的假阳性率在2～15%，假阴性率在5～45%。抗体检测不能鉴别是MTB的急性感染还是以前对MTB的暴露，更不能解决TBM早期诊断的问题。

结核抗原测定，由于MTB被吞噬、形成抗原抗体复合物，及抗原量少往往会造成一定的假阴性。另外，在结核抗原的检测中，由于MTB与属内外某些微生物有共同的抗原，往往会造成一定的假阳性。90年代后期发展起来的以PPD为抗原的外周血单个核细胞刺激试验或干扰素(IFN)-γ释放试验明显提高了诊断的灵敏性，但最大的缺陷仍是缺乏特异性抗原。因此，寻找结核特异性抗原对结核病诊断至关重要。

目前，TBM呈常年发病、不典型表现病例增多及各年龄组均有分布等特点，其中以不典型的临床表现和不典型的CSF实验室检查结果增多最为突出。加之上述结核杆菌检测方法的缺陷，因此获得一个能够诊断TBM的确切方法成为当务之急。

ESAT-6是MTB在感染早期分泌释放于菌体外的一种蛋白，游离于培养基中或存在于感染细胞的吞噬小体内。它仅存在于致病性分支杆菌中，包括人型结核杆菌、牛型结核杆菌、非洲分支杆菌及某些非典型分支杆菌(如堪萨斯分支杆菌、苏尔加分支杆菌和海水分支杆菌)。在MTB诸多的分泌蛋白中，ESAT-6在卡介苗和大多数非致病性分支杆菌中缺失，因此特异性较强。

发明内容

为克服现有临床上结核性疾病诊断方法方面的上述缺陷，本发明提供一种基于传统免疫细胞化学染色法检测结核杆菌分泌抗原ESAT-6的试剂盒，该试剂盒可从少量体液中简单，快捷的检测出结核杆菌。

本发明实现过程如下：

一种检测体液细胞中结核杆菌特异性分泌抗原的免疫细胞化学染色试剂盒，包括下述部件：

1）A液，1管，内装APES；

2）B液，1管，内装丙酮甲醛固定液；

3）C液，1管，内装0.3% TritonX-100；

4）D液，1管，内装封闭液；

5）E液，1管，内装兔源ESAT-6多克隆抗体；