[发明专利]一种检测体液细胞中结核杆菌特异性分泌抗原的免疫细胞化学染色试剂盒

权利要求书

1.一种检测体液细胞中结核杆菌特异性分泌抗原的免疫细胞化学染色试剂盒，其特征在于包括下述部件：

1）A液，1管，内装APES；

2）B液，1管，内装丙酮甲醛固定液；

3）C液，1管，内装0.3% TritonX-100；

4）D液，1管，内装封闭液；

5）E液，1管，内装兔源ESAT-6多克隆抗体；

6）F液，1管，内装抗兔生物素标记抗体；

7）G液，1管，内装辣根过氧化物酶标记链亲和素；

8）H液，2管，内装DAB显色液；

9）I液，1管，内装苏木素溶液。

2.根据权利要求1所述的检测体液细胞中结核杆菌特异性分泌抗原的免疫细胞化学染色试剂盒，其特征在于丙酮甲醛固定液的配置方法为：将丙酮45ml和甲醛25ml加入磷酸盐缓冲液中，并将pH值调至6.6，过滤备用；所述磷酸盐缓冲液由磷酸氢二钠20mg和磷酸二氢钾100mg溶于双蒸馏水30ml得到。

3.根据权利要求1所述的检测体液细胞中结核杆菌特异性分泌抗原的免疫细胞化学染色试剂盒，其特征在于0.3%TritonX-100的配置方法为：将30% TritonX-100稀释100倍，所述30% TritonX-100由30ml TritonX-100加入70ml双蒸水中混匀、过滤得到。

4.根据权利要求1所述的检测体液细胞中结核杆菌特异性分泌抗原的免疫细胞化学染色试剂盒，其特征在于封闭液的配置方法为：将小牛血清白蛋白1.00g，叠氮化钠0.08g，10ml胎牛血清加入70ml 0.01MPBS中，用盐酸或氢氧化钠调pH值至7.4，置4℃冰箱保存。

5.根据权利要求1所述的检测体液细胞中结核杆菌特异性分泌抗原的免疫细胞化学染色试剂盒，其特征在于：所述体液为脑脊液、尿、胸水、腹水、羊水、血液、前房液或中耳液。

6.权利要求1所述的检测体液细胞中结核杆菌特异性分泌抗原的免疫细胞化学染色试剂盒的使用方法，其特征在于：所述试剂盒使用时需要用细胞玻片离心沉淀仪收集细胞；采用2% 3-氨丙基-3-乙氧甲硅烷APES挂胶的载玻片；并采用0.3%TritonX-100处理细胞。

7.根据权利要求6所述的检测体液细胞中结核杆菌特异性分泌抗原的免疫细胞化学染色试剂盒的使用方法，其特征在于制作APES挂胶的载玻片操作步骤为：

1）将载玻片在碱性洗涤液中清洗晾干后，载玻片过酸清洗晾干；

2）将晾干的载玻片浸入经丙酮1∶50稀释的APES胶中30s，后经丙酮溶液浸泡30s，涮去未结合的APES，浸泡两次；

3）将挂好胶的载玻片晾干装盒备用。

8.根据权利要求6所述的检测体液细胞中结核杆菌特异性分泌抗原的免疫细胞化学染色试剂盒的使用方法，其特征在于包括以下步骤：

1）将APES挂胶的载玻片装载于细胞玻片离心沉淀仪上；

2）将体液细胞计数后根据每立方毫米细胞数滴加于载玻片上，于细胞玻片离心沉淀仪离心2-5分钟至细胞面刚刚干燥为止；

3）B液固定30秒，后蒸馏水自载玻片一端轻缓冲洗；

4）滴加C液于细胞面上处理细胞30分钟，后用pH 为7.4的0.01M磷酸盐缓冲液洗涤3次，每次3-5min；

5）滴加3%H₂O₂于细胞面上，置37℃湿盒内避光孵育10-30分钟，后用0.01M PBS洗涤3次，每次3-5min；

6）滴加D液于细胞面上，置37℃湿盒内孵育15-30分钟，后弃去D液；

7）滴加E液，置4℃冰箱，湿盒内孵育12 小时，后弃去E液，0.01M PBS洗涤3次，每次3-5分钟；

8）滴加F液于细胞面上，并完全覆盖细胞面，置37℃湿盒内温浴1小时，后弃去F液，0.01M PBS洗涤3次，每次3-5分钟；

9）滴加G液于细胞面上，并完全覆盖细胞面，置湿盒内37 ℃ 温浴1小时，后弃去G液，0.01M PBS洗涤3次，每次3-5分钟；

10）滴加H液于细胞面上，并完全覆盖细胞面，避光显色5-10分钟，后自来水冲洗，终止反应，I液复染3-5分钟，后自来水冲洗，并沥去载玻片上剩余的水，待载玻片干燥后镜检。