[发明专利]一种TaqMan探针实时荧光RT-PCR检测黄病毒的非诊断性方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种TaqMan探针实时荧光RT-PCR检测黄病毒的非诊断性方法。

背景技术

黄病毒科黄病毒属病毒与披膜病毒科甲病毒属病毒、呼肠孤病毒科病毒和布尼亚病毒科病毒均属于虫媒病毒，虫媒病毒是指通过吸血的节肢动物叮咬敏感的脊椎动物而引起的一种人兽共患的自然疫源性疾病，其中以黄病毒属病毒对人类的危害最大。人、畜一旦被携带病毒的节肢动物叮咬感染，就会带来疾病和死亡，当病毒大面积爆发时，会给爆发地经济带来巨大损失，引起社会恐慌，是各国公共卫生机构都有可能面临的问题。

目前，黄病毒主要的鉴定手段是病毒分离，但是由于其对实验条件要求苛刻、操作较复杂、技术难度高并且在检测时间长的同时伴随着严重的生物安全问题，所以无法再实际检测工作中推广使用。

近年来使用常规反转录PCR扩增(retro-transcript-PCR，RT-PCR)及实时荧光定量PCR(Real-time PCR)技术在黄病毒的检测方面发挥了重要作用。但目前使用的RT-PCR、实时荧光PCR大多只是针对某一种虫媒病毒的检测。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种快速、敏感的检测和筛选黄病毒属病毒的TaqMan探针实时荧光RT-PCR检测黄病毒的非诊断性方法。

为实现上述目的，本发明一种TaqMan探针实时荧光RT-PCR检测黄病毒的非诊断性方法，其特征在于，该非诊断性方法包括：

设计了一对引物和探针对待检样本进行实时定量检测，引物和探针序列如下：

进一步，所述探针连接的荧光基团为：FAM-BHQl，荧光探针5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的非荧光淬灭基团为BHQl。

进一步，所述该非诊断性方法包括步骤：

1)样本用裂解液和RNA抽提液处理，提取病毒RNA；

2)实时荧光RT-PCR反应，配制一定组分浓度的25μLPCR反应体系，

混匀后短暂离心分装到PCR管中；

3)将待测样品加入到反应体系中，进行扩增；

4)收集荧光信号，检测Ct值。

进一步，所述实时荧光RT-PCR反应的体系组分及其体积如下：

扩增条件：采用本领域的标准扩增条件。

附图说明

图1为乙脑病毒疫苗RNA扩增曲线。

图2为黄热病毒疫苗RNA扩增曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐释本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围，下列实施例中未注明具体实验条件和方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

1.待检样品为乙脑病毒疫苗，阳性对照为乙脑病毒株RNA，阴性对照为RNase-Free Water。

2.乙脑病毒疫苗RNA的提取：按QIAamp Viral RNA Mini Kit使用说明书提取样品RNA。

具体操作步骤如下：

①根据样本的数量分装裂解液AVL，每管560μl。

②取140μl病毒液加入到560μl分装好的AVL，涡旋震荡15秒，充分混匀，室温孵育10分钟。

③每管分别加入560μl的无水乙醇(96％-100％)，震荡15秒充分混匀，快速离心。

④从试剂盒中取出带滤柱的2ml的收集管，打开包装，做好标记。取步骤③中的混合液630μl加入到收集管中，8000rpm离心1分钟。

⑤将滤柱放置到新的2ml收集管中，将剩余的混合液全部吸入到滤柱中，8000rpm离心1分钟。

⑥取一个干净的2ml收集管，将滤柱移至新的收集管中，加入500μl洗脱液AW1，8000rpm离心1分钟。

⑦离心后，弃液，将滤柱放置到一个新的收集管中，加入500μl洗脱液AW2，14000rpm离心3分钟。弃液，再离心一次，以去除乙醇。

⑧将离心后的滤柱移到干净的1.5ml EP管中，加入60μl溶解液AVE，静置2分钟，12000rpm离心1分钟，即得到病毒RNA。

3.配制反应体系

每个反应管中包含以下试剂：

在1.5mL离心管中配制4个除模板RNA外的体系，混匀后短暂离心分装到3个PCR反应管中，分别加入阴性对照、乙脑病毒疫苗RNA、阳性对照。