[发明专利]一种蛋白水解度的检测方法及用于检测的试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物分析化学领域，具体的说，涉及一种蛋白水解度的检测方法及用于检测的试剂盒。

背景技术

蛋白质是由各种不同氨基酸通过肽键相连形成一级结构后再螺旋缠绕组成的高级结构，蛋白质的水解度可以代表蛋白质在水解过程中肽键被裂解的程度。在实际生产中，经常需要测定蛋白质的水解度来反映加工处理工艺的优劣或产品质量的好坏。目前国内、外常用的方法主要有：pH-state法、三硝基苯磺酸法、邻苯二甲醛法、水合茚三酮法、考马斯亮蓝法等，但这些方法都是以测定水解后的氨基酸含量的变化为基础或者直接测定样品中的蛋白质含量，比较适宜在单一蛋白质加工或氨基酸生产工艺中应用，而对含多种蛋白质或富含多种有机物的混合样品测定时，因存在大量的干扰源，如多糖、脂类等，使测定结果与真实值之间存在很大的差异，因此实际生产中需要更加精确、方便的检测系统与方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种能够在混合样品中检测蛋白质水解度的方法及用于检测的试剂盒，可用于餐厨垃圾处理、蛋白饲料生产、食品有机废水处理等复杂有机物加工和处理过程中蛋白质水解情况的检测。

本发明的目的通过下述技术方案予以实现：

一种蛋白水解度的检测方法，按照下述步骤进行：

(一)制备标准曲线和标准对比卡

配置溶解液，并将酪蛋白溶于溶解液中，定容得到标准蛋白溶液，例如称取酪蛋白0.25克溶于溶解液中，定容到25毫升配成标准蛋白溶液

配置测定液：配制质量百分数为10％的氢氧化钾水溶液，待用，再称取氯化铜、酒石酸钾钠和碘化钾溶解于蒸馏水中，搅拌加入质量百分数为10％的氢氧化钠水溶液，最后加蒸馏水定容到目标体积，使得各个溶质的最终质量百分数分别为氯化铜0.15％、酒石酸钾钠0.6％、碘化钾0.1％和氢氧化钾3％；

将标准蛋白溶液、溶解液和测定液配置成不同浓度的系列溶液，在分光光度计可见光区540nm处测定吸光度，以标准蛋白质含量为横坐标、测定的吸光度值为纵坐标，绘制成标准曲线，制成标准比对卡。例如按照下表进行混合均匀后，室温下放置30分钟后，在分光光度计可见光区540nm处测定吸光度。以标准蛋白质含量为横坐标、测定的吸光度值为纵坐标，绘制成标准曲线，制成标准比对卡

(二)检测样品中蛋白的水解度

分别向加工前与加工后的样品中加入沉淀液后静置，离心后去除上层清液，再向沉淀中加入洗脱液，离心后去除上层清液，然后向沉淀中加入溶解液，待溶解后向其中加入测定液，静置后，在540nm波长下进行吸光度测定，与标准比对卡进行比对，确定加工前后蛋白含量，二者的差值除以加工前蛋白含量即可计算出蛋白水解程度

本发明的方案中也可将加工前与加工后的样品溶于溶解液中后，再吸取样品溶液加入沉淀液，进行检测

其中溶解液选用氢氧化钾的水溶液，具体来说可以选用0.05摩尔/升的氢氧化钾水溶液；洗脱液选用乙醇和水的混合溶液，具体来说，将分析纯乙醇与蒸馏水按19∶1体积比混合后得到；沉淀液选用三氯乙酸的水溶液，具体来说，将固态三氯乙酸加热至60℃以上实现由固态向液态的转变后，再按照液态三氯乙酸和水3∶17的体积比与蒸馏水互溶。

一种用于检测蛋白水解度的试剂盒，包括溶解液、沉淀液、洗脱液、测定液及标准比对卡，其中：

溶解液选用氢氧化钾的水溶液，具体来说可以选用0.05摩尔/升的氢氧化钾水溶液；

洗脱液选用乙醇和水的混合溶液，具体来说，将分析纯乙醇与蒸馏水按19∶1体积比混合后得到；

沉淀液选用三氯乙酸的水溶液，具体来说，将固态三氯乙酸加热至60℃以上实现由固态向液态的转变后，再按照液态三氯乙酸和水3∶17的体积比与蒸馏水互溶；

所述测定液按照下述步骤进行制备：配制质量百分数为10％的氢氧化钾水溶液，待用，再称取氯化铜、酒石酸钾钠和碘化钾溶解于蒸馏水中，搅拌加入质量百分数为10％的氢氧化钠水溶液，最后加蒸馏水定容到目标体积，使得各个溶质的最终质量百分数分别为氯化铜0.15％、酒石酸钾钠0.6％、碘化钾0.1％和氢氧化钾3％