[发明专利]快速检测新疆出血热病毒的荧光定量RT-PCR试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学检测领域，特别涉及一种快速检测新疆出血热病毒的荧光定量RT-PCR试剂盒，试剂盒的检测方法及该试剂盒在临床、口岸检验新疆出血热病毒的应用。

背景技术

新疆出血热（Xinjian hemorrhagic fever，XHF）是由布尼亚病毒科内罗病毒属的新疆出血热病毒（Xinjian hemorrhagic fever virus，简称XHFV，又称克里米亚-刚果出血热病毒）引起的急性传染病，经蜱媒传播，主要流行于欧、亚、非三大洲，新疆出血热的发生有明显的季节性，每年4～5月为流行高峰，与蜱在自然界的消长情况及牧区活动的繁忙季节相符合。临床特征有发热、头痛、困倦乏力、呕吐、血尿、蛋白尿甚至休克等。目前对新疆出血热尚无特效治疗，原则应采取综合治疗措施，以控制出血和抗休克为主。因此早期快速诊断是控制病情，提高治愈率，避免临床误诊贻误治疗时机的关键。

我国部分地区的地理、气候、传播媒介-蜱、传染源等条件与欧、亚、非三大洲流行区相似，随着全球经济的发展，国际间的人群交往更为便利，全球贸易一体化和都市化生活等趋势使得病毒和传播媒介更易在各个国家之间传播。所以有必要建立新疆出血热病毒的快速分子生物学检测方法，在国境口岸对出入境人群和媒介生物进行早期快速的检测和监控，防止该传染病在口岸的传入，做到及时预防、控制疾病的传播，对保障我国的经济发展和人民身体健康有着重要的意义。

目前国内对新疆出血热病毒的研究较少，仅建立了该病毒的组织培养和RT-PCR检测方法。国外对新疆出血热病毒的诊断方法主要包括组织培养、血清学诊断和新发展的分子生物学方法。新疆出血热病毒的培养要求实验室的生物安全等级高，需在BSL-3实验室进行，病毒分离、鉴定的时间较长，且检测灵敏度不高；血清学方法主要包括（1）补体结合试验：主要检测补体结合抗体，阳性反应出现较迟，临床实验室较少采用；（2）中和试验：方法很复杂，一般不应用于临床；（3）血凝抑制试验，需采集双份血清标本，以第二份血清的抗体效价呈4倍以上升高为近期感染指标。此外，尚有报道采用捕获ELISA、间接免疫荧光等方法检测特异性抗体。

分子生物学方法与组织培养、血清学诊断相比，具有检测灵敏度高，特异性强和检测时间短等优点，但目前尚没有适合口岸快速检测新疆出血热病毒的荧光定量RT-PCR试剂盒。

发明内容

本发明的目的在于克服上述技术缺点，提供一种快速检测新疆出血热病毒的荧光定量RT-PCR试剂盒及检测方法，以适合临床、口岸等场新疆出血热病毒的快速检验。 

本发明的检测新疆出血热病毒的荧光定量RT-PCR试剂盒，其包括：

（1）RT-PCR反应选用的试剂盒为AgPath-ID? One-Step RT-PCR Kit（美国Ambion公司产品）。内含25×RT-PCR酶混合液：包含反转酶、热启动Taq酶；2×RT-PCR反应buffer和ROX阳性参照染料。

（2）正向引物100μL，浓度为12.5μM；

（3）反向引物100μL，浓度为17.5μM；

（4）荧光探针50μL，浓度为12.5μM；

（5）无菌DEPC水：5mL

（6）阳性对照：即含有新疆出血热病毒特异的基因RNA片断；

（7）阴性对照：无菌DEPC处理水。

所述引物对及荧光探针是合成的DNA片段，碱基序列分别为：

正向引物：5’-TGACAGCATT TCTTTAACAGACATCA-3’，

反向引物：5’-AAACACGGCAGCCTTAAGCA-3’，

荧光探针：5’-FAM-TCGCCAGGGACTTTATATTCTGCAAGG-TAMRA-3’。

上述引物、探针是用Lasergene软件包中的SeqMan程序分析从Genbank上获得的新疆出血热病毒核苷酸序列，选择有核苷酸特异的区域，用Primer Express2.0软件设计得到的特异性引物和探针，该引物和探针在新疆出血热病毒基因组上的定位依据是GenBank序列号为HQ833035.1的毒株序列，相关信息详见表1。

表1

应用上述试剂盒检测新疆出血热病毒的方法，按如下步骤进行：

（1）提取待测样品的RNA；

（2）RT-PCR扩增，方法如下：