[发明专利]一种高产γ-氨基丁酸的生产方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于医药生物与食品工程技术领域，是现代生物和化学工程与传统发酵工程技术的有机结合，对目前采用生物技术生产γ-氨基丁酸（GABA）方法的改进。更具体的说是采用从我国东北酸菜中分离选育的棉子糖肠球菌（Entercoccus raffinosus）CGMCC No.5584菌株，通过生长细胞的生物转化，高效率地生产γ-氨基丁酸。

背景技术

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)是一种非蛋白质组成的天然氨基酸，广泛存在于动植物体内。作为中枢神经系统重要的抑制性神经递质，GABA在人脑能量代谢过程中也起到重要作用。它参与多种代谢活动，具有降血压、调节心律失常、改善睡眠、抗焦虑、改善脂质代谢、防止动脉硬化等功效，因此受到越来越多的科学工作者的关注。在日本，这类富含GABA的功能性食品的研究取得了较大的进展。大久长范，津志田藤二郎等人分别利用富集技术以糙米、米胚芽、茶叶、大豆等为食品原料成功研制出了GABA大米、GABA茶等产品。

GABA的生产方法主要有化学合成、植物富集和生物合成三种。其中化学合成法副产物多，难以纯化，生产成本高，安全性差。植物合成GABA虽然工艺简单，但植物富集的GABA含量太少，不易提取，不适合工业化生产。生物合成一般以大肠杆菌为菌株，但其存在安全卫生方面的隐患。谷氨酸脱羧酶(Glutamate decarboxylase, GAD, EC4.1.1.15)在生物合成中，是催化谷氨酸脱羧生成GABA的唯一酶。谷氨酸已经通过发酵法获得大规模生产，价格相对较为便宜。利用微生物谷氨酸脱羧酶催化谷氨酸脱羧生产GABA，是一条有效策略。

目前已报道的采用乳酸菌生产GABA的方法有两种：一是：培养短乳杆菌的同时不断流加底物谷氨酸钠进行发酵，生成积累GABA。目前国内报道采用此法发酵最高水平为12g/L。二是：培养并获得大量富含谷氨酸脱羧酶的短乳杆菌细胞，收集此细胞并制成休止细胞，放入含有谷氨酸钠的缓冲液中，在最佳的谷氨酸脱羧酶酶促反应条件下，将谷氨酸转化为GABA，目前国内外报道生成的GABA可达345.83mM。

发明内容

/L左右，使得菌体产生的谷氨酸脱羧酶充分发挥作用，达到高效率的生产国际上公认最安全的原料药和保健食品—γ-氨基丁酸的目的。

因此，本发明的一个目的是公开了高产γ-氨基丁酸（GABA）的棉子糖肠球菌M1，其保藏号为CGMCC No.5584。

本发明的另一个目的是公开了CGMCC No.5584菌株的制备方法。

本发明的再一个目的是公开了采用CGMCC No.5584制备GABA的方法。

为实现上述目的，本发明提供如下的技术方案：

一种高产γ-氨基丁酸的生长棉子糖肠球菌（Entercoccus raffinosus）M1，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为：CGMCC No.5584。

本发明公开的棉子糖肠球菌Entercoccus raffinosus于2011年12月13号保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌株保藏号为CGMCC No.5584。

棉子糖肠球菌Entercoccus raffinosus CGMCC No.5584所具有的生理、生化特征如下：

(1)奥林巴斯双目显微镜观察菌株形态，菌株在梯度平板培养时因产酸而形成透明圈，菌落形态扁平湿润，边缘光滑呈白色不透明状态，镜检观察为链球状，不运动，无孢子，根据革兰氏染色法鉴定为革兰氏阳性细菌，兼性厌氧型。从众多高产菌株中得到一支产GABA较高的菌株，命名为菌株M1，在纸层析实验中，M1菌株对应的色斑颜色最深，产生的GABA的量最多。然后利用液相色谱仪进行定量分析。

（2）诱变结果及稳定性试验：

本发明的另一个目的是公开了棉子糖肠球菌M1 CGMCC No.5584的制备方法，其特征在于按如下步骤进行：

（1）菌株的初步筛选：从我国东北三省12个区域自然腌制的酸菜汤中，采用双层平板法，即含有1％的碳酸钙和谷氨酸钠，30℃培养48h，挑选在高浓度谷氨酸钠平板上生长且具有透明圈的菌落进行静置发酵，发酵温度30℃，发酵时间3d，采用高效液相色谱检测GABA含量，筛选出一株产量为16.95g/L的棉子糖肠球菌，编号为M3，转接在斜面上于4℃冰箱保藏；