[发明专利]一种高产γ-氨基丁酸的生产方法及应用

权利要求书

1.一种高产γ-氨基丁酸的生长棉子糖肠球菌（Entercoccus raffinosus）M1，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为：CGMCC No.5584。

2.一种制备权利要求1所述产γ-氨基丁酸的生长棉子糖肠球菌M1 CGMCC No.5584的方法，其特征在于按如下步骤进行：

（1）菌株的初步筛选：从我国东北三省12个区域自然腌制的酸菜汤中，采用双层平板法，即含有1％的碳酸钙和谷氨酸钠，30℃培养48h，挑选在高浓度谷氨酸钠平板上生长且具有透明圈的菌落进行静置发酵，发酵温度30℃，发酵时间3d，采用高效液相色谱检测GABA含量，筛选出一株产量为16.95g/L的棉子糖肠球菌，编号为M3，转接在斜面上于4℃冰箱保藏；

（2）菌株的再次筛选：复筛同样采用双层平板法，将M3从斜面挑两环至种子培养基中，其中的种子培养基(g/L)：蔗糖10，蛋白胨10，酵母浸出粉5，柠檬酸铵2，硫酸镁0.58，硫酸锰0.25，乙酸钠2，磷酸二氢钾2；30℃培养24h，然后涂于含有1％的碳酸钙和γ-氨基丁酸复筛平板上，30℃培养48h，挑选在高浓度γ-氨基丁酸平板上生长且具有透明圈的菌落进行静置发酵，发酵温度30℃，发酵时间3d，采用高效液相色谱检测GABA含量，筛选出一株产量为24.68g/L的棉子糖肠球菌，编号为M2，转接在斜面上于4℃冰箱保藏；

（3）将种子培养基中的菌株培养液以10%(v/v)接种量转接于驯化培养基（Ⅰ）中，在30℃下，160r/min摇床培养12h，再转接于驯化培养基（Ⅱ）中，最后经过分离纯化培养，获得单菌落，然后进行静置发酵，发酵温度30℃，发酵时间3d选取高产菌株；

其中的驯化培养基（Ⅰ）(g/L)：玉米糖化液10，蛋白胨10，酵母浸出粉15，微量元素液15mL，谷氨酸（Glu）60；其中微量元素液指的是含有氯化钠1mg/mL，硫酸亚铁1mg/mL，硫酸锰1mg/mL的溶液；

驯化培养基（Ⅱ）(g/L)：葡萄糖15，酵母粉20，蛋白胨10，谷氨酸70； 

（4）高产γ-氨基丁酸菌株的获得：利用复筛平板纯化后的菌株中筛选得到一株γ-氨基丁酸菌株（GABA），记为M1菌株，转接在斜面上于4℃冰箱保藏。

3.权利要求2所述的制备方法，其中步骤（4）中的分纯指的是：将高产菌株在种子培养基中进行液体静置培养，培养温度30℃，培养时间12h，并取1mL培养液将其稀释成10^-7～10^-9后涂布于平板上，30℃培养1～2d，观察菌落形态和革兰氏染色形态,结果，记录并拍照。

4.一种采用权利要求1所述CGMCC No.5584制备γ-氨基丁酸GABA的方法，其特征在于：在发酵过程中分为细胞生长和细胞转化两个阶段采取不同的pH和通氧控制步骤如下：

 (1)获得种子液：以10%的接种量，30℃静置培养12h为一轮活化，然后将活化6轮的棉子糖肠球菌以10%的接种量接入装有种子培养基的容器内，30～40℃下在有氧环境下静置培养10～20h，得到种子液；其中的种子培养基(g/L)：蔗糖10，蛋白胨10，酵母浸出粉5，柠檬酸铵2，硫酸镁0.58，硫酸锰0.25，乙酸钠2，磷酸二氢钾2；

（2）发酵培养：在发酵罐中倒入培养基，高压蒸汽灭菌后冷却至30℃，将种子液以重量百分比5～15%接种量接种到发酵罐中，静置、间歇搅拌发酵60h；

发酵培养基的成分为：蔗糖10～30g/L，酵母浸出粉10～30g/L，乙酸钠1～5g/L，磷酸氢二钾2～5g/L，Al₂（SO₄）₃·16H₂O 0.1～0.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.1～0.5g/L，（NH₄）₂SO₄·12H₂O 0.1～0.5g/L，吐温80 0.1～0.4mL/L，初始pH5.5～6.5，底物8～15g/L，单独灭菌；

（3）调pH：发酵过程中，初始pH为5.5-6.5不控制，添加底物后当pH高于5.5时开始补酸，通过补加盐酸保持pH在4～6；其中所述的底物为9%谷氨酸钠(MSG)。