[发明专利]一种离子交换色谱分离乳源αs-酪蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明涉及组分分离技术，具体涉及一种离子交换色谱分离乳源α_s-酪蛋白的方法。

背景技术

乳制品因其乳蛋白含量丰富，营养价值高，容易被人体消化吸收而被公认为是对人身体和智力发育有良好的作用的健康食品，乳中最有价值的成分也就是乳蛋白，主要包含酪蛋白和乳清蛋白，还有少量脂肪球蛋白，其中酪蛋白含量约占乳蛋白的 80%～82%。是由多种蛋白质组成的混合物，酪蛋白（casein，CN）又称为干酪素，由四种组分组成，包括α_s-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白，α_s-酪蛋白又分为α_s1-酪蛋白和α_s2-酪蛋白，约占酪蛋白总量的48%，是乳源酪蛋白生物活性肽的主要来源。

α_s-酪蛋白可作为食品添加剂，应用于食品的生产，改善食品的风味；α_s-酪蛋白是含磷蛋白复合体，经水解可产生酪蛋白磷酸肽（CPP），促进人体钙吸收，因此α_s-酪蛋白可作为酪蛋白磷酸肽制备的最优原料；此外α_s-酪蛋白水解可产生抗菌肽、免疫肽、阿片肽、抗高血压肽以及促进矿物组织吸收，促进免疫，激素调节，抗病毒，降血脂等生物活性肽，且一些生物活性肽已经运用于工业化生产。现今的α_s-酪蛋白分离技术大致可分为三种：化学分级沉淀法，色谱法和钙低温系统分离法。虽然化学分级沉淀法和钙低温系统分离法较为常用，但其分离的条件要求严格（如钙低温系统分离法对温度的依赖高），且分离出的α_s-酪蛋白常常混有酪蛋白的其他组分，在酪蛋白生物活性肽的研究应用中受到较多的限制，如陆晓民的发明专利（专利申请号：200510096244.5）名称为一种酪蛋白组分分离方法及应用和张列兵等人的发明专利（专利申请号：201010144728.3）名称为一种α_s-酪蛋白的分离方法，分离出的α_s-酪蛋白纯度最高为97.8%。而色谱法有分辨率高，操作简易，重复性好，成本低等优点在蛋白质纯化过程中广泛应用。

离子交换色谱（Ion exchange chromatography，IEC），也叫离子交换层析，是利用离子交换介质对各种离子的亲和力不同，借以分离混合物中各种离子的一种层析技术，其主要特点是依靠带有相反电荷的颗粒之间的吸引力的作用。离子交换色谱的固定相是离子交换剂，它是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物质，通过一定的化学反应共价结合上某种电荷基团形成的，可分为三部分：高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子。电荷基团与高分子聚合物共价结合，形成一个带电的可进行离子交换的基团。平衡离子是结合于电荷基团上的相反离子，它能与溶液中其他的离子基团发生可逆的交换反应，根据其交换的离子基团种类不同又分为阳离子交换剂（与带正电的基团交换）和阴离子交换剂（与带负电的基团交换）。流动相是具有一定pH值和一定离子强度的电解质溶液。蛋白质在不同pH值缓冲液中，可带有游离的氨基或羧基可与离子交换剂的基团进行交换吸附。用缓冲液进行洗脱，当缓冲液中的离子基团与结合在离子交换剂上的蛋白质基团相竞争时，亲和力小的蛋白质分子先被解吸而被洗脱下来，而亲和力大的后被解吸下来。

发明内容

本发明的目的在于根据现有技术中存在的上述不足，提供一种α_s-酪蛋白离子交换色谱分离法。本方法以酪蛋白素为原料，用离子交换色谱法，经不连续梯度洗脱，寻找能洗脱出蛋白的离子强度所含有的盐的浓度，将α_s-酪蛋白与酪蛋白其他组分分离，得到高纯度的α_s-酪蛋白。

本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：

酪蛋白为酸性蛋白质，在pH>pI时带负电荷，可选择阴离子交换剂进行分离，而酪蛋白不同组分所带电荷不同，与离子交换剂结合程度不同，因此改变洗脱液的离子强度可使不同组分分离开来。本发明所用的离子交换介质DEAE-Sepharose CL-6B，经其分离得到的α_s-酪蛋白纯度可为100%。

本方法以购买得到的酪蛋白全素为原料。离子交换色谱分离α_s-酪蛋白组分的分离方法包括以下步骤：

（1）取标准酪蛋白全素用样品缓冲液A液配制浓度为4mg/ml的标准液，冰箱4℃放置12h，0.45μm滤膜过滤后备用。