[发明专利]一种乳铁蛋白肽的制备方法及其在食品抑菌中的应用方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种抑菌剂的制备和应用方法，更具体的说，涉及一种乳铁蛋白肽的制备及其在食品抑菌中的应用方法。

背景技术

食品安全是关系国计民生的大事，全天然绿色抑菌剂的开发与应用是中国乃至世界的前沿课题。乳铁蛋白(Lactoferrin，LF)是一种天然存在、广泛分布于人和家畜乳汁、唾液、眼泪等外分泌液的铁结合糖蛋白，具有安全无害的特点。乳铁蛋白多肽(Lactoferricin，Lfcin)是LF在消化道内经酸性胃蛋白酶水解后的小肽。大量研究表明，Lfcin具有广谱抗细菌、抗病毒、抗真菌活性，它们虽然没有铁离子结合位点，但杀菌活性却比LF高，可用于开发新型的保健食品和绿色食品添加剂。但开发Lfcin会遇到许多困难，其中，遇到的最大问题是制造成本太高，大量制造较困难，难以实现商品化。应用基因工程技术将牛乳铁蛋白肽(Lfcin B)基因转入其他生物中表达，是解决工业用Lfcin B来源不足的最具潜力的途径。

申请号“CN200610166536.6”，发明名称“一种牛乳铁蛋白工程菌及抗菌肽牛乳铁蛋白素的制备方法”的中国专利(申请)，公开了通过发光杆菌基因工程菌制备抗菌肽牛乳铁蛋白素的制备方法；申请号“CN200810110996.6”，发明名称“乳铁蛋白抗菌肽及其制备方法与他们的用途”的中国专利(申请)，公开了通过酶水解牛初乳中乳铁蛋白制备乳铁蛋白抗菌肽的方法和在奶粉、酸奶、饮料中作为抑菌剂的用途；申请号“CN200810116875.2”，发明名称“牛乳铁蛋白抗菌肽融合蛋白及其编码基因与应用”的中国专利(申请)，公开了牛乳铁蛋白抗菌肽融合蛋白的编码及利用编码基因培育的植物作为生物反应器生产抗菌肽的方法；

上述这些专利(申请)均未涉及到利用大肠杆菌重组表达牛乳铁蛋白肽和重组牛乳铁蛋白肽用于食品的抑菌处理，特别是牛奶和水产品，以提高食品特别是生食海鲜的食用安全性。

发明内容

本发明的目的是提供一种牛乳铁蛋白肽的制备方法，该方法易行，操作简单，高校表达，成本低廉，该方法制备所得的牛乳铁蛋白肽具有高效广谱抗菌活性。

本发明的另一目的是提供上述牛乳铁蛋白肽用于水产品和牛奶中抑菌的使用方法。

为实现本发明的目的，本发明的技术方案是：

一种牛乳铁蛋白肽的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(i)基因工程菌活化：基因工程菌在含硫酸卡那霉素的LB培养基上活化后，在发酵培养基上发酵，3～5小时后乳糖诱导6～10小时；

(ii)细菌裂解：将诱导后的菌体加入到裂解缓冲液中，混匀后37℃孵育过夜，离心去上清，加入等体积包涵体洗涤缓冲液，37℃孵育2～3小时后，再离心去上清；

(iii)包涵体分离和裂解：将细菌包涵体加入到蒸馏水中振荡洗涤0.5～1.5小时，离心去上清，然后再在包涵体分离液中振荡洗涤10～30min，离心去上清，最后再加入到包涵体裂解液中连续振荡18～22小时，离心收集上清(含融合蛋白)；

(iv)融合蛋白提取和酸水解：用0.68倍体积的乙醇沉淀上述上清中的融合蛋白，-20℃预冷10～30分钟后，离心收集沉淀和上清，再用3.5倍体积的乙醇沉淀上清中的融合蛋白，两次乙醇沉淀均为融合蛋白，将融合蛋白在盐酸溶液中，40～56℃水解25～35h；

(v)凝胶色谱分离：调节步骤(iv)得到的融合蛋白酸水解产物pH与洗脱液基本一致，经滤膜过滤后上样于平衡过的CM52离子交换柱，洗脱液洗脱，收集样品峰，采用平衡过的Sephadex G-25层析柱对样品进行脱盐，洗脱液洗脱，收集样品峰，所得蛋白进行冷冻干燥即为牛乳铁蛋白肽。

在本发明的一优选实施例中，所述基因工程菌为：E.coli-pED-Lfcin B BL21分泌表达牛乳铁蛋白肽融合蛋白。

在本发明的一优选实施例中，步骤(i)中，所述发酵培养基为：可溶性淀粉7g/L，牛肉膏30g/L，氯化钠6.7g/L。

在本发明的一优选实施例中，步骤(ii)，所述菌体裂解缓冲液为：溶菌酶，其质量百分数为0.02％，聚乙醇辛基苯基醚，其体积分数为0.5％，Tris-HCl，其pH值为8.0，浓度为50mmol/L，所述菌体裂解缓冲液的用量为，每克细菌加入4mL；

在本发明的一优选实施例中，步骤(ii)中，所述包涵体洗涤缓冲液为：TritonX-100，其体积百分数为0.2％，Tris-HCl，其pH值为8.0，浓度为50mmol/L。