[发明专利]一种乳铁蛋白肽的制备方法及其在食品抑菌中的应用方法

权利要求书

1.一种牛乳铁蛋白肽的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(i)基因工程菌活化：基因工程菌在含硫酸卡那霉素的LB培养基上活化后，在发酵培养基上发酵，3～5小时后乳糖诱导6～10小时；

(ii)细菌裂解：将诱导后的菌体加入到裂解缓冲液中，混匀后37℃孵育过夜，离心去上清，加入等体积包涵体洗涤缓冲液，37℃孵育2～3小时后，再离心去上清；

(iii)包涵体分离和裂解：将细菌包涵体加入到蒸馏水中振荡洗涤0.5～1.5小时，离心去上清，然后再在包涵体分离液中振荡洗涤10～30min，离心去上清，最后再加入到包涵体裂解液中连续振荡18～22小时，离心收集上清(含融合蛋白)；

(iv)融合蛋白提取和酸水解：用0.68倍体积的乙醇沉淀上述上清中的融合蛋白，-20℃预冷10～30分钟后，离心收集沉淀和上清，再用3.5倍体积的乙醇沉淀上清中的融合蛋白，两次乙醇沉淀均为融合蛋白，将融合蛋白在盐酸溶液中，40～56℃水解25～35h；

(v)色谱柱分离：调节步骤(iv)得到的融合蛋白酸水解产物pH与洗脱液基本一致，经滤膜过滤后上样于平衡过的CM52离子交换柱，洗脱液洗脱，收集样品峰，采用平衡过的Sephadex G-25层析柱对样品进行脱盐，洗脱液洗脱，收集样品峰，所得蛋白进行冷冻干燥即为牛乳铁蛋白肽。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(i)中，所述基因工程菌为：E.coli-pED-Lfcin B BL21分泌表达牛乳铁蛋白肽融合蛋白。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(i)中，所述发酵培养基为可溶性淀粉7g/L，牛肉膏30g/L，氯化钠6.7g/L。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(ii)，所述菌体裂解缓冲液为：溶菌酶，其质量百分数为0.02％，聚乙醇辛基苯基醚，其体积分数为0.5％，Tris-HCl，其pH值为8.0，浓度为50mmol/L，所述菌体裂解缓冲液的用量为，每克细菌加入4mL；

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(ii)中，所述包涵体洗涤缓冲液为：Triton X-100，其体积百分数为0.2％，Tris-HCl，其pH值为8.0，浓度为50mmol/L。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(ii)中，所述离心速度为8000r/min，时间为20min。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(iii)中，所述包涵体分离液为2mol/L的尿素溶液。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(iii)中，所述包涵体裂解液为尿素-Tris-HCl溶液(pH8.0)，其中尿素的浓度为4mol/L，Tris-HCl的浓度为100mmol/L、pH为8.0，按1g包涵体添加4mL裂解液的比例进行。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(iv)中，盐酸溶液浓度为50mM，水解过程中融合蛋白的质量含量为5％。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(v)中，所述滤膜为0.45μm；平衡和洗脱CM52离子交换柱的平衡液和洗脱液分别为0.08mol/L乙酸铵溶液，0.24mol/L乙酸铵溶液，洗脱条件为0.5mL/min；平衡和洗脱Sephadex G-25层析柱的平衡液和洗脱液均为0.1M乙酸溶液，洗脱条件为5mL/min。

11.权利要求1-10任一项所述的方法制备所得的牛乳铁蛋白肽在食品抑菌中的应用方法，将水产品清洗干净后，浸没于新鲜配制的牛乳铁蛋白肽溶液中，在常温泡在或0-4℃条件下，浸泡0.5-10小时，

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述牛乳铁蛋白肽溶液的浓度为1000μg/mL，水产品质量与牛乳铁蛋白肽溶液的质量比为1∶1～10。