[发明专利]一种抗禽流感的功能性饲料添加剂的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及饲料添加剂领域，具体地说是一种具有抗禽流感病毒感染的禽用功能性饲料添加剂的制备方法。

背景技术

禽流感疾病是由A型禽流感病毒引起的一种禽类急性高度接触性传染疾病，能够感染多种家禽、野禽和哺乳动物，甚至传播人类。目前，针对禽流感疾病还没有真正有效的治疗方法，针对于感染禽流感动物的处理方法主要是进行扑杀和焚烧，这种处理方式给整个发病地区带来了损失和不便。虽然疫苗接种是对防治禽流感暴发和流行起到了积极的作用，但禽流感病毒变异速度快，造成了免疫失败或效果不理想。且目前市场应用的疫苗以传统疫苗为主，其通过对活病毒的培养和灭活制备而成，其成本高、操作繁琐、对环境存在污染和散毒可能等缺点。

在实际生产中，通过疫苗来预防禽流感的发生需要很长的免疫操作时间，比如对万只鸡场进行注射免疫，需要约3天的时间，如果养殖数量更多，操作时间更长。同时，疫苗的生产和使用成本较高，养殖投入资金大，生产成本高。为此，鉴于目前防控禽流感的现状，本发明通过基因工程手段制备了一种表达H5N1亚型禽流感病毒蛋白亚单位的工程藻株。加上藻体本身的诸多优点，将其开发作为一种新型的功能性饲料添加剂。该添加剂不仅能够促进机体的生长、提高机体的体质和改善机体肉质品质等作用外，更重要的是，其具备了抵抗禽流感病毒感染的作用，在禽类养殖业和饲料加工业中有着广阔的应用前景和巨大的市场经济价值。

发明内容

本发明针对上述问题提供一种抗禽流感的功能性饲料添加剂的制备及其应用，借助于转基因技术，将H5N1亚型禽流感病毒的部分血凝素基因转入杜氏藻细胞，将获得的工程藻细胞收集后，直接作为一种饲料添加剂投喂家禽，对养殖禽类抵抗禽流感的感染起到很好的免疫保护作用。

一种抗禽流感的功能性饲料添加剂的制备及其应用，其具体步骤为：

步骤一、工程藻的制备

（1）H5N1禽流感血凝素基因的制备：：根据GenBank中登录的H5N1亚型禽流感病毒的血凝素(HA) 基因序列，人工合成HA基因的部分片段（基因序列如序列表序列1）。然后采用PCR的方法对该基因片段进行扩增。PCR的上游引物为p1：5’TCTAGAATGCGCAGCATGTCCATACCATA3’，下游引物为p2：5’GAGCTCAATGTGGATTCTTTGTCTGC 3’， 下划线所指为上下游引物分别引入的Xba ?和Sac ?酶切位点；

（2）真核表达载体的pBI-HA构建：将鉴定正确的HA基因片段进行Xba ?和Sac ?双酶切，然后采用Axygene公司胶回收试剂盒回收HA基因片段。将真核载体pBI-221进行Xba ?和Sac ?双酶切，同样进行胶回收载体片段。通过T4连接酶将HA基因片段连接到真核表达载体pBI-221上，将连接体系转化入大肠杆菌感受态。挑起阳性菌落培养后进行质粒的提取，采用Xba ?和Sac ?进行双酶切鉴定说明HA基因片段是否成功构建入真核表达载体中，得到正确的重组质粒；

（3）利用电转化法将重组质粒转化杜氏藻细胞：将鉴定正确的重组质粒通过基因枪、电转化等转化方法将重组质粒转化入杜氏藻细胞。通过对转基因细胞的筛选，结合RT-PCR扩增等分子生物方法的鉴定，制备得到表达禽流感病毒亚蛋白单位的工程藻细胞；

步骤二、工程藻的扩大培养

在实验室条件下，步骤一制备的表达禽流感病毒亚蛋白单位的工程藻细胞接种到15L玻璃瓶中进行扩大培养，当细胞生长至对数生长期时，按1%的接种量接种于天然海水的藻类养殖场，进行规模化的生产培养，培养约10-14天，细胞的浓度可增加为10⁶个/ml；

步棸三、工程藻的收集和加工处理

当工程藻细胞生长至10⁶个/ml 时，对藻类细胞进行收集。可以采用静止沉降或离心沉降法，批量的收集藻体。收集后的转基因可经过低温干燥、制粒、粉碎或与其它营养成分混合等加工工艺后，，得到一种抗禽流感的功能性饲料添加剂；

步骤四、饲料添加剂在禽类养殖业和饲料加工业中的应用：饲料添加剂应用到禽类饲料中，添加量为0.5-5%，添加形态可以为粉剂、颗粒剂等固体形式、也可以是糊剂、丸剂等半固体形式，也可以是液体形式。通过使用该饲料添加剂，能够明显提高禽类机体的免疫力和改善机体体质，促进禽类机体生长，改善养殖禽类肉、蛋品质。