[发明专利]一种抗禽流感的功能性饲料添加剂的制备方法

权利要求书

1.一种抗禽流感的功能性饲料添加剂的制备方法，其特征在于：其具体步骤为：

步骤一、工程藻的制备

（1） H5N1禽流感血凝素基因的制备：根据GenBank中登录的H5N1亚型禽流感病毒的血凝素基因序列，人工合成血凝素基因的部分片段，其基因序列如序列表序列1，然后采用PCR的方法对该基因片段进行扩增；PCR的上游引物为p1：5’TCTAGAATGCGCAGCATGTCCATACCATA3’，下游引物为p2：5’GAGCTCAATGTGGATTCTTTGTCTGC 3’， 下划线所指为上下游引物分别引入的Xba ?和Sac ?酶切位点；

（2）真核表达载体的pBI-HA构建：将鉴定正确的血凝素基因片段进行Xba ?和Sac ?双酶切，然后采用胶回收试剂盒回收血凝素基因片段片段；将真核载体pBI-221进行Xba ?和Sac ?双酶切，同样进行胶回收载体片段；然后通过T4连接酶连接血凝素基因片段和真核表达载体pBI-221，将连接体系转化入大肠杆菌感受态，挑选阳性菌落培养后进行质粒的提取，采用Xba ?和Sac ?进行双酶切鉴定血凝素基因片段是否成功构建入真核表达载体中，得到正确的pBI-HA重组质粒，备用；

（3）利用电转化法将重组质粒转化杜氏藻细胞：将鉴定正确的重组质粒通过基因枪、电转化等转化方法将重组质粒转化入杜氏藻细胞；通过对转基因细胞的筛选，结合分子生物方法的鉴定，得到表达禽流感病毒亚蛋白单位的工程藻细胞；

步骤二、工程藻的扩大培养

将步骤一制备的表达禽流感病毒亚蛋白单位的工程藻细胞接种到15L玻璃瓶中进行扩大培养，当细胞生长至对数生长期时，按1%的接种量接种于天然海水的藻类养殖场，进行规模化的生产培养，培养约10-14天，细胞的浓度增加为10⁶个/ml；

步骤三、工程藻的收集和加工处理

当工程藻细胞生长至10⁶个/ml 时，对藻类细胞进行收集；可以采用静止沉降或离心沉降法，批量的收集藻体；收集后的藻体经过低温干燥、制粒或与其它营养成分混合加工后，得到一种抗禽流感的功能性饲料添加剂。