[发明专利]SIRT6的调节物及其筛选分析

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2010年12月22日提交的申请号为61/426,231的美国临时专利申请的优先权，其在此全文参考并入。

关于联邦政府资助研究的声明

本申请是在美国国立卫生研究院提供的合同号为GM086703的政府资助下进行。政府对本申请享有一定权利。

发明背景

去乙酰化酶（Sirtuin）是一类称为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）依赖性去乙酰基酶的酶。人类有七种sirtuin，Sirt1-7，其调控多种生物学过程，包括衰老、转录和代谢。因此，能够调节sirtuin活性的小分子可以用于治疗若干人类疾病。

在这七种人类sirtuin中，Sirt6特别重要，因为其作用为调控代谢和基因组的稳定性。Sirt6的生物学功能使其有望成为治疗脂肪肝疾病、肥胖症和糖尿病的靶点。因而，能够活化、抑制或以其他方式调节Sirt6的小分子将在治疗此类疾病和状况中非常有益。

疟疾寄生虫恶性疟原虫含有两个sirtuin，PfSir2a和PfSir2b。已知这些sirtuin调控致病基因的表达、抗原变异和抗原基因的表达，其有助于疟疾寄生虫逃避宿主免疫系统的检测。因而，能够抑制或以其他有益方式调节这些sirtuin的小分子能够用于治疗疟疾，这也将是非常有益的。

Sirt6和PfSir2a抑制物的研发受到缺乏对Sirt6和PfSir2a有效的活性分析特别是能够用于高通量筛选的方法的阻碍。研发有效的Sirt6和PfSir2a活性分析的这种困难主要是由Sirt6和PfSir2a的去乙酰基酶活性非常弱造成的。在这七种哺乳动物sirtuin中，Sirtuin4-7具有较弱的或不具有去乙酰基酶活性。已知Sirt6的功能为是组蛋白H3K9-和H3K56-特异性去乙酰基酶，因为其他酰基肽不能被Sirt6水解。然而，去乙酰基酶的活性非常弱，迄今为止尚无k_cat和K_m检测的报告。类似地，已知PfSir2a的去乙酰基酶活性比人Sirt1弱得多。

发明简述

本申请发现了当赖氨酸上的酰基基本上是疏水的，特别是当酰基含有较高碳原子数（例如，至少5、6、7、8、9、10或更高的碳原子数）的烃基如长链烷基或烯基时，Sirt6是酰基-赖氨酸残基的选择性去酰基酶。Sirt6的这种选择性活性与已知的其他sirtuin的选择性形成鲜明对比。例如，Sirtuin1、2和3已知具有强劲的去乙酰酶活性，而Sirtuin5已知能够容易地从赖氨酸残基上除去丙二酰基、琥珀酰基和戊二酰基。相反地，本申请发现了与其去乙酰基酶活性相比，Sirt6明显能够更加有效地（例如，有效性超过30倍以上）从赖氨酸残基上除去长链疏水性脂肪酰基。与Sirt6类似，人们发现PfSir2a和Sir7的去乙酰基酶活性也非常弱，但其能够更高效地除去长链脂肪酰基。

利用Sirt6这种新发现的活性，本申请描述了一种方法，该方法能够在不同条件下和存在任意多种可能的Sirt6调节物的情况下，有效测定Sirt6（和具有类似活性的sirtuin，如PfSir2a和Sirt7）的活性水平。因此，尽管通过观察去酰基酶的活性几乎无法测定Sirt6、PfSir2a或Sirt7的活性水平或鉴定其调节物（即，调控物，包括活化物或抑制物），但是本申请已发现了一种通过引入含有长链脂肪酰赖氨酸结构的底物测定Sirt6、PfSir2a或Sirt7的活化水平或鉴定其调节物（即，调控物，包括活化物或抑制物）以及测定不同条件下Sirt6-、PfSir2a-或Sirt7-介导酰基水解的效能的有效方法。本申请描述的方法还能有利地用于对能够调节Sirt6、PfSir2a或Sirt7活性的小分子进行高通量筛选。

通过本申请描述的方法鉴定的Sirt6-、PfSir2a-或Sirt7-特异性调节物能够用于治疗或预防多种以Sirt6、PfSir2a或Sirt7活性异常或处于非最佳状态为特征的多种疾病。这些疾病包括与代谢（例如，肥胖症）、糖尿病、疟疾和基因组稳定性相关的那些疾病。