[发明专利]用于核酸扩增的方法、组合物、系统、仪器和试剂盒

说明书

本发明提供了新颖的在载体上制备固定化克隆扩增子的局部化群体的方法。

本申请要求下述申请的优先权：2011年10月28日提交的美国临时申请号61/552,660；2011年8月23日提交的美国临时申请号61/526,478；2011年3月11日提交的美国临时申请号61/451,919；2010年2月22日提交的美国临时申请号61/445,324；和2010年12月17日提交的美国临时申请号61/424,599；它们中的每一篇通过引用整体并入。

背景技术

核酸扩增在分子生物学中是非常有用的，且在生物学、治疗、诊断、法医学和研究的几乎每个方面中具有广泛的适用性。通常，使用一种或多种引物从起始模板制备多个扩增子，其中所述扩增子与用于制备它们的模板是同源的或互补的。多路扩增还可以使过程流线化，并减少开销。可以将单组引物与不同的模板相混合，或者可以使单一模板与多种不同的引物接触，或者可以使多种不同的模板与多种不同的引物接触。本申请涉及用于核酸扩增和/或分析的方法和试剂。

发明内容

本文提供了核酸扩增和/或分析的方法、试剂和产品。扩增可以使用固定化的和/或可溶性的引物。从本文提供的方法制备的扩增子是适合用于其它分析(例如，序列测定)的底物。

附图说明

图1：显示模板步移(template walking)的一个实施方案的示意图。在一个替代实施方案中，固定化的引物包含被命名为(A)_n的富含腺苷的序列，例如，(A)₃₀，且固定化的引物在模板上的引物结合位点包含互补的富含T的序列，例如，(T)₃₀。

图2：通过模板步移在珠子上进行扩增、以及在平面阵列上沉积珠子进行测序的概述。

图3：使用基于半导体的合成测序检测的替代实施方案。可以使用模板步移在珠子上或在反应室的基底或底部上制备克隆扩增子群体。在一个替代实施方案中，固定化的引物包含被命名为(A)_n的富含腺苷的序列，例如，(A)₃₀，且固定化的引物在模板上的引物结合位点包含互补的富含T的序列，例如，(T)₃₀。

图4：在平面衬底上的引物坪(primer lawn)形式的固定化位点的替代实施方案。可以使用分离的固定化位点的阵列，或者可以将引物的单个连续坪(lawn)视作固定化位点的随机阵列。任选地，在引物的连续坪中的一个或多个固定化位点的位置可以是尚未确定的，其中所述位置在初始模板步移之前在连接时确定，或者通过扩增簇占据的空间来确定。在一个替代实施方案中，固定化的引物包含被命名为(A)_n的富含腺苷的序列，例如，(A)₃₀，且固定化的引物在模板上的引物结合位点包含互补的富含T的序列，例如，(T)₃₀。

图5：温度对模板步移反应的影响。计算在模板步移扩增之前和之后的δCt，并相对于反应温度绘制其图形。

图6：96双链体TaqMan qPCR反应的Ct值的表。

图7：通过模板步移在珠子上的100,000倍扩增。计算在模板步移反应之前和之后的δCt、以及在模板步移反应之前和之后的扩增倍数，并相对于反应时间绘图。

图8：一个示例性的链倒转(strand-flipping)和步移策略的示意描绘。(A)模板步移，(B)链倒转以产生倒转链，(C)新引物结合序列Pg'在最终的倒转链上的添加。

定义