[发明专利]用于核酸扩增的方法、组合物、系统、仪器和试剂盒

权利要求书

1.一种引物延伸的方法，所述方法包括：

a)使第一引物分子，即“第一正向引物”，与来自多个核酸模板的未固定化的核酸链，即“反向链”，上的互补的引物结合序列，即“反向链PBS”，杂交；

b)通过使用所述反向链作为模板延伸所述第一正向引物分子，产生延伸的第一正向链，所述延伸的第一正向链是所述反向链的全长互补物且与所述反向链杂交；

c)使所述核酸反向链上的引物结合序列的至少一部分与所述第一正向引物分开；

d)使第二引物分子，即“第二正向引物”，与所述反向链PBS杂交，其中所述反向链也与所述第一正向链杂交；和

e)通过一个或多个包括在等温条件下的步骤(b)至(d)的扩增循环来在单个连续液相中同时地扩增所述核酸模板，从而形成在空间上隔开的克隆核酸群体，其中第一个扩增循环的步骤(d)的第二正向引物是后续扩增循环的步骤(b)的第一正向引物；其中大部分的反向链在所述一个或多个扩增循环过程中或之间的所有时间与正向链杂交；且其中所述连续液相中没有部分被完全细分或隔离、或以其它方式与液体主体的剩余部分完全物理上分离；

其中所述第一正向引物和第二正向引物固定化在载体上，其中所有正向引物在序列方面是相同的或者具有相同的3’部分，且其中没有反向引物固定在所述载体上；并且

其中步骤(c)中的所述部分分开是通过下述方式来实现的：(i)使用重组酶和/或单链结合蛋白；或(ii)将所述等温条件调至高于所有正向引物的Tm、但是低于所述反向链的Tm的温度，其中反向链的Tm是这样的温度：在该温度，相同反向链的克隆群体中的一半所述反向链从完美互补的链完全变性，所述完美互补的链在它的整个长度内与所述反向链完全杂交。

2.根据权利要求1所述的方法，所述方法包括，如下扩增所述反向链：

a)使第一反向引物分子与延伸的正向链上的互补的反向引物结合序列，即“正向链PBS”，杂交，其中所述第一反向引物分子在溶液中；

b)通过使用所述正向链作为模板以模板依赖性的方式延伸所述第一反向引物分子，产生延伸的第一反向链，所述延伸的第一反向链是所述正向链的全长互补物且与所述正向链杂交；和

c)使第二引物，即“第二反向引物”，与所述正向链PBS杂交，其中所述正向链也与所述第一反向链杂交；

并且包括：通过步骤(b)至(c)的一次或多次重复来扩增所述反向链，其中步骤(c)的第二反向引物是重复的步骤(b)的第一反向引物；且其中大部分的正向链在所述一次或多次重复过程中或之间的所有时间与反向链杂交。

3.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其中所有正向引物的Tm不超过50℃、55℃、60℃或65℃，且其中所述反向链的Tm不小于95℃、90℃、85℃、80℃或75℃。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其中在等温条件下进行扩增，并且其中将所述等温条件调至高于所有正向引物的Tm、但是低于所述反向链的Tm的温度，其中反向链的Tm是这样的温度：在该温度，相同反向链的克隆群体中的一半所述反向链从完美互补的链完全变性，所述完美互补的链在它的整个长度内与所述反向链完全杂交。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述载体包括具有一个或多个固定化位点的单一载体，所述固定化位点是在所述单一载体上的在空间上分开的区域。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述载体包括珠子，且其中每个珠子在扩增以后包含扩增子的克隆群体，其中每个珠子分布在阵列的单独的孔中，且进行通过合成的测序，并任选地，其中所述阵列是大规模FET阵列。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述引物延伸导致一个或多个可检测的标记向延伸的固定化的核酸链中的掺入。

8.根据权利要求1所述的方法，所述方法另外包括下述步骤：处理一个或多个延伸的固定化的核酸链，从而释放核酸分子或其部分，任选地，其中所述处理由用限制性内切核酸酶或用核酶切割组成。