[发明专利]获得抗旱植物的方法

说明书

技术领域

本发明是关于遗传工程，尤其是关于植物和植物来源的组织的转基因和同源转基因（cisgenesis）方法，并且更尤其是关于选择遗传转化植物细胞的方法，所述方法避免了使用抗性基因毒性物质作为可选择标记物并且使转化细胞不产生对所述植物细胞、植物或其最终使用者和中间物具有潜在副作用的蛋白质和/或新的或不同的代谢物。因此，本发明的方法使用了一种包含促进内源性海藻糖酶抑制的核酸序列的核苷酸序列，其赋予由这一选择方法获得的植物耐旱性。

背景技术

众所周知，当通过转化将遗传物质引入细胞群体中时，仅一定数目的细胞成功地转化。在转化后，必须从转化和未转化细胞群体中鉴别并且选出这些转化细胞。已使用传统方法“阴性选择（negative selection）”鉴别和分离转化细胞，在阴性选择中转化细胞可以存活和生长，而未转化细胞生长受到抑制或被由于转化而转化细胞可以耐受的物质消除。为了实现这一目的，通常细胞引入除相关转基因以外的选择基因。

这一选择基因通常提供抗生素或除草剂抗性，可以通过所述抗生素或除草剂抗性鉴别遗传转化细胞。在转化后，转化和未转化细胞群体接着在含有抗生素或除草剂的培养基中生长，转化细胞由于选择基因而对抗生素或除草剂具有抗性，因此使不含抗生素或除草剂抗性基因的转化细胞生长受到抑制，使得仅转化细胞由于存在引入的基因选择而能够存活和生长。

这些实例尤其包括专利US6174724和EP0131623，其使用编码酶II型新霉素（neomycin）磷酸转移酶（nptll）的基因作为选择标记物，此酶赋予对氨基糖苷（卡那霉素（kanamycin）、新霉素、G418、巴龙霉素（paromycin））家族中某些抗生素的抗性；以及专利US4727027，其使用潮霉素（hygromycin）磷酸转移酶基因（hpt）提供对潮霉素抗生素的抗性。

尽管观测到有效性，但阴性选择法具有一些缺点。例如，未转化细胞由于生长培养基中存在抗生素或除草剂而死亡，并且因此存在不仅未转化细胞并且转化细胞也可能死亡的风险，因为受损害的未转化细胞或在消除过程中可能分泌有毒化合物。

另一个极重要的缺点是根据环境和食品安全性观点，对于在环境中大规模引入和释放的遗传修饰和同源转基因的作物，尤其粮食作物，通常不推荐使用这些提供对有毒化合物的抗性的选择基因。

阴性选择的另一个缺点是用毒性物质处理的细胞或植物组织变得对细菌性感染更加敏感。这在使用土壤杆菌（Agrobacterium）作为转化载体的时候产生问题，因为虽然使用抗生素进行预防，但组织或细胞可能有时仍显示细菌过度生长。

在阳性选择法中，可提及专利US6444878和US5767378，其使用用于将对细胞具有毒性的化合物代谢掉的基因。第一份专利描述了使用一种核苷酸序列，其编码葡萄糖胺-6-磷酸脱胺酶基因作为在含有毒性代谢物葡萄糖胺或其衍生物的培养基中生长的遗传转化细胞的抗性基因。第二份专利描述了使用一组编码与甘露糖或其衍生物或前驱体代谢相关的磷酸曼诺异构酶（phosphomanoisomerases）、磷酸曼诺变构酶甘露糖表构酶等的基因，以及将任何这些毒性化合物添加到选择培养手段中。两种情况和使用抗生素和除草剂抗性基因都可以引起遗传转化细胞除产生异种蛋白，所述异种蛋白除产生过敏原外还会对已被选择和无需这一产物的转化有机体产生代谢成本。

最近，专利US7449290描述了一种遗传转化细胞的选择方法，其使用编码具有海藻糖酶活性的蛋白质的核苷酸序列作为选择标记物，所述蛋白质催化海藻糖或其甲基化或卤化衍生物。在这一方法中，海藻糖酶过度表达，使得遗传转化细胞能够历经有毒浓度的添加到选择培养基中的代谢物后存活。与前述情况相同，遗传修饰的有机体呈现出过度产生在选择过程后不必要的蛋白质，并且涉及将额外化合物添加到选择培养基中。

可使用本发明的方法通过阳性选择来克服（至少实质上）上文提及的缺点，本发明的方法允许在不通过使群体的未转化细胞中毒而进行消除下并且在不共同引入抗生素抗性基因、除草剂和其他化合物的情况下鉴别和分离遗传转化细胞，所述方法也避免了向培养基中添加额外化合物的需要。本发明的方法还避免了额外产生在选择过程结束时不必要的蛋白质或多肽。