[发明专利]蛋白质的生产方法

说明书

技术领域

本发明涉及将包含含有编码目标蛋白质的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体导入至少一种悬浮性哺乳动物细胞中、将插入在一对转座子序列之间的基因片段重组到该哺乳动物细胞的染色体中的方法、对生产该蛋白质的悬浮性哺乳动物细胞进行悬浮培养而生产该蛋白质的方法、表达该蛋白质的悬浮性哺乳动物细胞以及包含含有编码目标蛋白质的DNA的基因片段且在该基因片段的两端含有一对转座子序列的表达载体。

背景技术

利用基因重组技术的外源蛋白质的生产在药品和食品行业等各种产业中得到利用。多数情况下，重组蛋白质的生产通过如下方法进行：将含有编码目标蛋白质的碱基序列的表达载体导入大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、植物细胞和动物细胞等宿主中，选择出该表达载体重组到染色体中而得到的转化株，再将该转化株在适当的培养条件下培养而使其表达目标蛋白质。

但是，为了开发出能够高效地生产外源蛋白质的宿主，需要根据每种目标蛋白质选择出生产率良好的宿主细胞，因而期望对各个宿主中的外源蛋白质生产技术进行进一步的技术革新。

大肠杆菌等细菌和酵母的系统与动物细胞不同，大多难以进行糖链修饰等翻译后修饰，在生产具有活性的蛋白质的方面成为问题。

昆虫细胞的系统具有如下优点：所生产的蛋白质接受磷酸化、糖链附加等翻译后修饰，能够在保持原有的生理活性的状态下进行表达。但是，分泌蛋白质的糖链结构与来源于哺乳类的细胞的糖链结构不同，因此，用于药品用途时抗原性等成为问题。

另外，昆虫细胞的系统在外源基因的导入中使用重组病毒，因此，从安全性的观点出发，存在需要使其灭活或将其包埋的问题。

对于动物细胞的系统而言，能够以更等同于生物体中制造的蛋白质的方式对以人类为代表的高等动物来源的蛋白质进行磷酸化、糖链附加、折叠等翻译后修饰。这种准确的翻译后修饰是在重组蛋白质中重现蛋白质本来具有的生理活性所必需的，对于需要这种生理活性的药品等，经常使用以哺乳动物细胞为宿主的蛋白质生产系统。

但是，以动物细胞为宿主的蛋白质表达系统的生产率一般较低，导入基因的稳定性也大多存在问题。提高以哺乳动物培养细胞为宿主的蛋白质的生产率不仅在治疗用药品或诊断药品等的制造中非常重要，对于它们的开发研究也有很大贡献。因此，当务之急是开发以哺乳动物培养细胞、特别是中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)为宿主且能够容易地获得高生产株的基因表达系统。

转座子是能够从染色体的一个基因座移动到另一个基因座的转座性遗传因子。转座子是分子生物学或遗传学的研究中强有力的工具，基于突变导入、基因捕获、转基因个体的制作等目的用于昆虫或线虫(例如黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)或秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans))和植物中，但这种技术的开发在包括哺乳动物细胞在内的脊椎动物中很缓慢。

但是，近年来，在脊椎动物中也报道了具有活性的转座子，并且确认了其中若干转座子在小鼠或人类等的哺乳动物细胞中也具有活性。作为代表性的转座子，可以列举：由青鳉克隆得到的转座子Tol1(专利文献1)、Tol2(非专利文献1)、由存在于鲑科鱼类基因组中的非自主性转座子重构而成的睡美人(Sleeping Beauty)(非专利文献2)、青蛙来源的人工转座子青蛙王子(Frog prince)(非专利文献3)、昆虫来源的转座子piggyBac(非专利文献4)。

这些DNA转座子作为用于给哺乳动物细胞的基因组带来新的表现型的基因导入工具已经用于突变导入、基因捕获、转基因个体的制作、表达抗药性蛋白质等(非专利文献5～12)。

对于昆虫而言，研究了使用鳞翅目昆虫来源的转座子piggyBac将外源基因导入家蚕染色体并使其表达该外源基因所编码的蛋白质的方法，并公开了使用该技术的蛋白质生产方法(专利文献2)。

但是，由于所表达的目标蛋白质的表达量不充分且在家蚕全身都有生产，因此，为了从存在大量杂质蛋白质的体液中以高纯度的形式回收表达的外源蛋白质，需要高度的纯化技术，因此在经济方面存在问题。

另外，已知使用来源于青鳉的Tol2转座子在哺乳动物细胞中表达与G418抗性相关的蛋白质的例子(非专利文献12、非专利文献13)。