[发明专利]能够使甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖连接脱帽并使磷酸化的N-聚糖脱甘露糖基化的甘露糖苷酶及促进糖蛋白的哺乳动物细胞摄取的方法

说明书

本发明提供了能够使甘露糖‑1‑磷酸‑6‑甘露糖模块脱帽并使磷酸化的N‑聚糖脱甘露糖基化的甘露糖苷酶、使用此类甘露糖苷酶的方法、使用该方法生成的糖蛋白、以及促进糖蛋白的哺乳动物细胞摄取的方法。

发明领域

本发明涉及甘露糖苷酶，其能(i)将甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖连接或模块水解成磷酸-6-甘露糖，并且(ii)水解此类含有磷酸(phosphate)的聚糖的末端alpha-1,2甘露糖、alpha-1,3甘露糖和/或alpha-1,6甘露糖连接或模块。本发明还涉及促进糖蛋白的哺乳动物细胞摄取的方法。

发明背景

需要高性能表达系统来生产目前开发下的大多数生物药物(例如，重组蛋白)。许多这些生物药物的生物学活性依赖于其翻译后修饰(例如，磷酸化或糖基化)。基于酵母的表达系统组合具有分泌及修饰蛋白质的能力的微生物生物体容易遗传操作和发酵。然而，酵母细胞中生成的重组糖蛋白展现主要为异质的高甘露糖和超甘露糖聚糖结构，其对于蛋白质功能、下游加工、及随后的治疗性用途，特别地是在糖基化起生物学重要作用的情况中可以是不利的。

发明概述

本文件基于如下的发现，即(i)能将甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖连接或模块（moiety）水解为磷酸-6-甘露糖(本文中又称为“甘露糖-6-磷酸”)(“脱帽”)并水解此类含有磷酸的聚糖的末端alpha-1,2甘露糖、alpha-1,3甘露糖和/或alpha-1,6甘露糖连接或模块(“脱甘露糖基化”)的甘露糖苷酶；以及(ii)需要脱帽和脱甘露糖基化两者(通过不同酶或单一酶进行)来实现糖蛋白的哺乳动物细胞摄取，等等

在一个方面，本文件特征在于在糖蛋白上使甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖连接或模块脱帽并使磷酸化的N-聚糖脱甘露糖基化的方法。该方法包括提供具有含甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖连接或模块的磷酸化N-聚糖的糖蛋白；并使糖蛋白与甘露糖苷酶接触，所述甘露糖苷酶能够(i)将甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖连接或模块水解为甘露糖-6-磷酸，并且(ii)水解末端alpha-1,2甘露糖、alpha-1,3甘露糖和/或alpha-1,6甘露糖连接或模块。甘露糖苷酶可以是家族38糖基水解酶。甘露糖苷酶可以来自直生刀豆(Canavalia ensiformis)或解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。

本文件特征还在于一种使磷酸化的N-聚糖脱甘露糖基化的方法。该方法包括包括提供包含磷酸化的N-聚糖的糖蛋白；并使糖蛋白与甘露糖苷酶接触，所述甘露糖苷酶能够(i)将甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖连接或模块水解为甘露糖-6-磷酸，并且(ii)水解末端alpha-1,2甘露糖、alpha-1,3甘露糖和/或alpha-1,6甘露糖连接或模块。甘露糖苷酶可以是家族38糖基水解酶。甘露糖苷酶可以来自直生刀豆或解脂耶氏酵母。

本文中所描述的方法可以进一步包括在提供和接触步骤后，使哺乳动物细胞与包含脱甘露糖基化的磷酸化N-聚糖的糖蛋白接触，其中，在接触后，糖蛋白转运到哺乳动物细胞(例如，人细胞)内部。