[发明专利]单核苷酸多态性的实时PCR检测

说明书

技术领域

本申请要求在2010年10月4日提交的第61/389,412号美国临时专利申请，在2010年10月7日提交的第61/390,701号美国临时专利申请，以及在2011年6月13日提交的第13/158,593号美国专利申请的优先权，通过引用将这些申请的全部内容包含于此。

本公开描述了使用单核苷酸多态性(SNP)特异性的CataCleave^TM探针对SNP的实时PCR检测。

背景技术

人类基因组计划(HGP)的完成已经为更好地了解在给定人类种群内的基因多样性以及该多样性与基因疾病的起始和诱因如何相关铺平了道路。例如，称为单核苷酸多态性(SNP)的个体之间的单核苷酸差异可能是造成表型的巨大差异的原因，其在某些情况下可以预测谁将患某种疾病或者谁将对这些疾病的特定治疗做出反应。药物基因组学领域正在快速地接近根据病人基因组成定制药物治疗。对病人的DNA中的基因突变的快速和可靠的检测可以指导医师的临床诊断和药物治疗的选择。这在肿瘤学中尤其正确，其中，致癌基因的编码区域内的离散突变的存在可以有力地预测癌症的易感性和预后。

例如，在大多数的医疗实践中，对在BRCA的肿瘤抑制基因中的有害突变的存在的基因检测现在是常规的。有害的BRCA-1突变可以大大增加妇女在早期(更年期之前)患乳房癌和/或卵巢癌的风险以及患宫颈癌、子宫癌、胰腺癌和结肠癌的风险。有害的BRCA-2突变可以另外增加胰腺癌、胃癌、胆囊和胆管癌以及黑色素瘤的风险。在包括TP53、PTEN、STK11/LKB1、CDH1、CHEK2、ATM、MLH1和MSH2的若干其他基因中的突变已经与遗传性乳房和/或卵巢肿瘤有关。

伴随出现核酸扩增，可以将任何DNA序列的低至单个的分子复制足够的次数以允许SNP序列分析。可以通过诸如DNA测序、荧光探针检测、质谱分析法或DNA微阵列杂交(例如，第5,885,775号、第6,368,799号美国专利)的各种技术检测SNP。然而，由于总体差的灵敏度、成本、时间消耗或者对PCR后处理的需要，这些方法中的许多方法仍然不适于高通量应用。此外，现有的SNP检测方法具有不可接受的高水平的假阳性和/或假阴性的结果。

由于上述的原因，现有技术未满足在DNA扩增的同时对SNP进行精确的实时检测的需要。

发明内容

技术问题

描述了用于在实时PCR中使用包括DNA和RNA序列的特异性探针的快速检测SNP的方法和试剂盒。该方法能够有助于以经济和可靠的方式对单个PCR片段进行一个或多个SNP的高通量检测。

在一个实施例中，公开了一种用于靶DNA中的多态性的实时检测的方法，包括以下步骤：提供将被检测具有多态性的靶DNA的存在的样品；提供可以退火到靶DNA的成对的扩增引物，其中，第一扩增引物在多态性的位置的上游退火，第二扩增引物在多态性的位置的下游退火；提供包括可检测的标签以及DNA和RNA核酸序列的探针，其中，探针的RNA核酸序列与包含多态性的靶DNA序列的选择区域完全互补，探针的DNA核酸序列与和靶DNA序列的选择区域相邻的DNA序列基本上互补；在扩增聚合酶活性、扩增缓冲液、RNA酶H活性和探针的存在下，在探针中的RNA序列可以与包含多态性的PCR片段中的互补的DNA序列形成RNA:DNA异源双链体的条件下，扩增第一扩增引物和第二扩增引物之间的PCR片段；以及检测来自探针上的标签的信号发射的实时增加，其中，信号的增加表明靶DNA中存在多态性。

在一个方面中，来自探针上的标签的信号发射的实时增加是由于RNA酶H对在RNA:DNA异源双链体中的探针的RNA序列的切割。

在另一个实施例中，公开了一种用于靶DNA中的多态性的实时检测的方法，所述方法包括以下步骤：提供将被检测具有多态性的靶DNA的存在的样品；提供可以退火到靶DNA的成对的扩增引物，其中，第一扩增引物在多态性的位置的上游退火，第二扩增引物在多态性的位置的下游退火；提供包括可检测的标签以及DNA和RNA核酸序列的探针，其中，探针的RNA核酸序列与在多态性的位置包含野生型DNA序列的靶DNA序列的选择区域完全互补，探针的DNA核酸序列与和靶DNA序列的选择区域相邻的DNA序列基本上互补；在扩增聚合酶活性、扩增缓冲液、RNA酶H活性和探针的存在下，在探针中的RNA序列可以与包含多态性的PCR片段中的互补的DNA序列形成RNA:DNA异源双链体的条件下，扩增第一扩增引物和第二扩增引物之间的PCR片段；以及检测来自探针上的标签的信号发射的实时降低，其中，信号的降低表明靶DNA中存在多态性。