[发明专利]单核苷酸多态性的实时PCR检测

权利要求书

1.一种用于靶DNA中的多态性的实时检测的方法，包括以下步骤：

a)提供将被检测具有多态性的靶DNA的存在的样品；

b)提供能够退火到靶DNA的扩增引物对，其中，第一扩增引物在多态性的位置的上游退火，第二扩增引物在多态性的位置的下游退火；

c)提供包括可检测的标签以及DNA和RNA核酸序列的探针，其中，探针的RNA核酸序列与包含多态性的靶DNA序列的选择区域完全互补，探针的DNA核酸序列与和靶DNA序列的选择区域相邻的DNA序列基本上互补；

d)在扩增聚合酶活性、扩增缓冲液、RNA酶H活性和探针的存在下以及探针中的RNA序列能够与包含多态性的PCR片段中的互补的DNA序列形成RNA:DNA异源双链体的条件下，扩增第一扩增引物和第二扩增引物之间的PCR片段；以及

e)检测来自探针上的标签的信号发射的实时增加，

其中，信号的增加表明靶DNA中存在多态性。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，来自探针上的标签的信号发射的实时增加是由于RNA酶H对在RNA:DNA异源双链体中的探针的RNA序列的切割。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，探针的RNA核酸序列包含与靶DNA中的多态性互补的序列。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，多态性是单核苷酸多态性。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，探针的DNA和RNA序列是共价连接的。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，探针上的可检测标签是荧光标签。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，荧光标签包含荧光共振能量转移对。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，PCR片段被连接到固体载体。

9.一种用于靶DNA中的多态性的实时检测的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供将被检测具有多态性的靶DNA的存在的样品；

b)提供能够退火到靶DNA的扩增引物对，其中，第一扩增引物在多态性的位置的上游退火，第二扩增引物在多态性的位置的下游退火；

c)提供包括可检测的标签以及DNA和RNA核酸序列的探针，其中，探针的RNA核酸序列与在多态性的位置包含野生型DNA序列的靶DNA序列的选择区域完全互补，探针的DNA核酸序列与和靶DNA序列的选择区域相邻的DNA序列基本上互补；

d)在扩增聚合酶活性、扩增缓冲液、RNA酶H活性和探针的存在下以及探针中的RNA序列能够与包含多态性的PCR片段中的互补的DNA序列形成RNA:DNA异源双链体的条件下，扩增第一扩增引物和第二扩增引物之间的PCR片段；以及

e)检测来自探针上的标签的信号发射的实时减小，

其中，信号的减小表明靶DNA中存在多态性。

10.一种用于靶RNA中的多态性的实时检测的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供将被检测具有多态性的靶RNA的样品；

b)提供能够退火到靶RNA的cDNA的扩增引物对，其中，第一扩增引物在多态性的位置的上游退火，第二扩增引物在多态性的位置的下游退火；

c)提供包括可检测的标签以及DNA和RNA核酸序列的探针，其中，探针的RNA核酸序列与包含多态性的cDNA的选择区域完全互补，探针的DNA核酸序列与和cDNA的选择区域相邻的DNA序列基本上互补；

d)在逆转录酶活性、扩增聚合酶活性、逆转录PCR缓冲液、RNA酶H活性和探针的存在下以及探针中的RNA序列能够与包含多态性的逆转录PCR DNA片段中的互补的序列形成RNA:DNA异源双链体的条件下，扩增第一扩增引物和第二扩增引物之间的逆转录PCR片段；以及

e)检测来自探针上的标签的信号发射的实时增加，

其中，信号的增加表明靶RNA中存在多态性。

11.根据权利要求10所述的方法，其中，来自探针上的标签的信号发射的实时增加是由于RNA酶H对在RNA:DNA异源双链体中的探针的RNA序列的切割。

12.根据权利要求10所述的方法，其中，探针的RNA核酸序列包含与在靶RNA中的多态性的位置处的cDNA互补的RNA序列。

13.根据权利要求10所述的方法，其中，多态性是单核苷酸多态性。