[发明专利]使用靶向核酸内切酶和单链核酸的基因组编辑

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2010年11月4日提交的美国临时申请号61/410,124、2010年9月15日提交的美国临时申请号61/382,965和2010年7月23日提交的美国临时申请号61/367,022的优先权，所述每个申请据此以引用方式整体并入。

发明领域

本发明总体上涉及使用靶向核酸内切酶和单链核酸编辑特定染色体序列。

发明背景

常规的基因组工程具有贯穿基础研究、药物发现和基于细胞的药物的巨大潜力。许多用于靶向基因敲除、诱变或整合的现有方法依赖于同源重组。然而，许多细胞中低自发重组率以及筛选工作规模和分离靶向事件所要求的时间已经阻碍这个领域中的进展。因此，存在对于可以以高的速度、效率和准确度快速实现靶向基因组编辑的技术的需要。

发明简述

在本公开的各个方面，提供了一种用于编辑细胞中至少一种内源染色体序列的方法。这种方法包括向细胞中引入(i)至少一种靶向核酸内切酶或编码靶向核酸内切酶的核酸，其中所述靶向核酸内切酶能够在染色体序列中靶向的切割位点处引入双链断裂，和(ii)至少一种单链核酸，其包含与靶向切割位点的至少一侧上的染色体序列具有显著序列同一性的第一部分。该方法还包括将所述细胞在如此条件下维持，从而通过同源重组法(homology-directed process)修复由靶向核酸内切酶引入的双链断裂，从而所述染色体序列与单链核酸的序列交换，因而编辑所述染色体序列。

又一个方面提供一种用于编辑细胞中染色体序列的试剂盒。该试剂盒包含(a)至少一种靶向核酸内切酶或编码靶向核酸内切酶的核酸，其中所述靶向核酸内切酶能够在染色体序列中靶向的切割位点处引入双链断裂，和(b)至少一种单链核酸，其包含与靶向切割位点的至少一侧上的染色体序列具有显著序列同一性的第一部分。

下文更详尽地描述本公开的其他方面和特征。

对彩色图片的参考

本申请文件含有彩色制作的至少一张照片。此专利申请公开连同彩色照片的副本将由专利办公室在请求并支付必需费用时提供。

附图简述

图1展示用来修饰RSK2激酶基因座的寡核苷酸的设计。在顶部展示RSK2激酶野生型基因组序列，同时指出ZFN结合位点。在底部展示携带特定突变的寡核苷酸的序列。

图2记录了BamHI位点整合至RSK2激酶基因座中。细胞汇集物用BamHI消化并且片段由凝胶电泳分离。

图3描述了在RSK2激酶基因座处携带BamHI位点的分离的单个细胞克隆。将各个克隆中的RSK2基因座进行PCR扩增并且用BamHI消化。

图4图示了用来修饰AAVS1基因座的寡核苷酸的设计。在顶部展示AAVS1野生型基因组序列，同时指出ZFN结合位点。下方显示包含位点的有义和反义寡核苷酸的序列。

图5显示HindIII位点整合至AAVS1基因座中。上图描述与ZFN和寡核苷酸接触的细胞，并且下图描述与仅寡核苷酸接触的细胞。细胞汇集物用HindIII消化并且片段由凝胶电泳分离。

图6描述了在AAVS1基因座处携带HindIII位点的分离的单个细胞克隆。将各个克隆中的AAVS1基因座进行PCR扩增并且用HindIII消化。

图7显示使用不同长度的有义寡核苷酸，使HindIII位点整合至AAVS1基因座中。将源自细胞汇集物的基因组DNA进行PCR扩增并且用HindIII消化。沿顶部的数字指每种寡核苷酸的核苷酸长度。M代表标记，G代表GFP(即，无ZFN对照)，并且Z代表ZFN。

图8描述使用不同长度的反义寡核苷酸，使HindIII位点整合至AAVS1基因座中。将源自细胞汇集物的基因组DNA进行PCR扩增并且用HindIII消化。沿顶部的数字指每种寡核苷酸的核苷酸长度。M代表标记，G代表GFP(即，无ZFN对照)，并且Z代表ZFN。

图9显示当ZFN作为与不同长度的寡核苷酸组合的mRNA或DNA递送时，使HindIII位点整合至AAVS1基因座中。将源自细胞汇集物的基因组DNA进行PCR扩增并且用HindIII消化。沿顶部的数字指每种寡核苷酸的核苷酸长度。R代表RNA，D代表DNA，M代表标记，G代表GFP(即，无ZFN对照)，并且Z代表ZFN。