[发明专利]使用靶向核酸内切酶和单链核酸的基因组编辑

权利要求书

1.一种用于编辑细胞中至少一种内源染色体序列的方法，所述方法包括：

a)向细胞中引入(i)至少一种靶向核酸内切酶或编码靶向核酸内切酶的核酸，所述靶向核酸内切酶能够在染色体序列中靶向的切割位点处引入双链断裂，和(ii)至少一种单链核酸，其包含与靶向切割位点的至少一侧上的染色体序列具有显著序列同一性的第一部分；和

b)将所述细胞在如此条件下维持，从而通过同源重组法修复由所述靶向核酸内切酶引入的双链断裂，从而所述染色体序列与所述单链核酸的序列交换，因而编辑所述染色体序列。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述单链核酸包含与靶向的切割位点的另一侧上的染色体序列具有显著序列同一性的第二区域。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述单链核酸还包含相对于所述染色体序列的至少一个核苷酸变化，从而编辑的染色体序列包含至少一个核苷酸的插入、至少一个核苷酸的缺失、至少一个核苷酸的置换或其组合。

4.根据权利要求2所述的方法，其中所述单链核酸还包含侧面为所述第一区域和所述第二区域的外源序列，从而所述编辑的染色体序列包含整合的外源序列。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述单链核酸包含与位于靶向的切割位点上游或下游的远端染色体序列具有显著序列同一性的第二区域，从而编辑的染色体序列包含缺失。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述单链核酸还包含侧面为所述第一区域和所述第二区域的外源序列，从而所述编辑的染色体序列还包含整合的外源序列。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述单链核酸是线形或环形的。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述单链核酸具有约20个核苷酸至约100,000个核苷酸的长度。

9.根据权利要求1所述的方法，其中所述单链核酸包含脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、核糖核苷酸模拟物、修饰的核苷酸、2’-O-甲基核苷酸、锁核酸、肽核酸或其组合。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述单链核酸包含磷酸二酯键、硫代磷酸酯键、磷酰亚胺键、磷酰二胺键或其组合。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述单链核酸是有义或反义的。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述单链核酸与靶向切割位点的至少一侧上的至少10个核苷酸具有至少约90%序列同一性。

13.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶向核酸内切酶是锌指核酸酶、大范围核酸酶、转录激活物样效应物(TALE)核酸酶、位点特异性核酸酶或人工靶向DNA双链断裂诱导剂。

14.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括将至少一种供体多核苷酸引入所述细胞中。

15.根据权利要求14所述的方法，其中将一种靶向核酸内切酶、包含与靶向切割位点的上游侧具有显著序列同一性的第一部分的第一单链核酸、包含与靶向切割位点的下游侧具有显著序列同一性的第一部分的第二单链核酸和一个供体多核苷酸引入所述细胞中，所述供体多核苷酸包含与第一单链核酸的第二部分具有显著序列同一性的第一序列和与第二单链核酸的第二部分具有显著序列同一性的第二序列，并且其中所述供体多核苷酸的第一和第二序列位于用于插入所述染色体序列中的序列的侧面。

16.根据权利要求14所述的方法，其中将第一靶向核酸内切酶、包含与第一靶向核酸内切酶的靶向切割位点的上游侧具有显著序列同一性的第一部分的第一单链核酸、第二靶向核酸内切酶、包含与第二靶向核酸内切酶的靶向切割位点的下游侧具有显著序列同一性的第一部分的第二单链核酸和一个供体多核苷酸引入所述细胞中，所述供体多核苷酸包含与所述第一单链核酸的第二部分具有显著序列同一性的第一序列和与所述第二单链核酸的第二部分具有显著序列同一性的第二序列，并且其中所述供体多核苷酸的第一和第二序列位于用于插入染色体序列中的序列的侧面。

17.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞是培养的细胞、原代细胞、永生细胞、干细胞、诱导的多潜能干细胞(iPS)或单细胞胚。

18.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞是人细胞、哺乳动物细胞、脊椎动物细胞、无脊椎动物细胞或单细胞真核生物。