[发明专利]用于检测存在于肉中的驴肉的试剂盒

说明书

发明领域

本发明涉及包含特异性引物-探针组的试剂盒，其借助于实时PCR TaqMan探针技术用于检测肉产品中存在的驴肉。

发明背景

聚合酶链反应（PCR）简言之是通过与侧接待扩增的DNA区段的3'-末端互补的短单链寡核苷酸序列（引物），对DNA上的一个或多个靶区的酶促扩增过程。在PCR应用中，在扩增属于任何生物的特异性基因或基因区域以获得足够的遗传材料用于分析后，可以使用次级方法通过进一步分析扩增子（PCR产物）执行物种鉴定。近年来，开始使用给出定量结果的实时聚合酶链反应（PCR）方法，以便检测肉产品中的物种。在实时PCR方法中，靶基因的扩增通过增加的荧光信号进行监控，所述荧光信号与反应中的PCR产物量按比例增加。

在实时PCR方法中，水解探针（TaqMan?探针）方法在为检测肉物种执行的研究中是特别优选的，因为发出的荧光信号的强度与每个循环中产生的PCR产物（扩增子）的量平行。在这种方法中，使用荧光标记的寡核苷酸探针（荧光标记的短单链寡核苷酸分子）。它设计为在PCR反应的退火和延伸期期间退火到引物内部的靶序列。以其游离完整形式，无法测量荧光发射，因为报道染料的荧光发射被猝灭染料吸收。然而，一旦在探针退火到靶链之一后，探针将被Taq聚合酶的5' -3'外切核酸酶活性降解。因此，报道和猝灭染料变得分离，并且报道染料的发射不再转移至猝灭染料，导致报道荧光发射增加。这个过程在每个循环中发生且不干扰PCR产物的指数累积。荧光的增加按循环进行测量且与形成的PCR产物量直接关联。在其下超过阈值的循环数目称为“Ct（循环阈值）值”，并且它给出关于靶DNA区域的起始量的信息。

对于靶物种特异性的PCR引物仅在合适反应条件下在它们对于其特异性的DNA的存在下产生PCR产物。待扩增的DNA片段根据所检测的目的个体、群体、物种或家族所显示的差异水平进行选择。待用于物种区分的靶DNA片段的碱基序列需要显示出在物种之间的最大差异和在物种内的个体和群体之间的最小差异。因此，将在靶向基因区域的扩增中使用的寡核苷酸引物和探针的特异性直接鉴定方法的特异性。

关于用实时PCR TaqMan探针技术检测肉产品中的驴的首个和仅有研究已由Chisholm等人执行。他们使用TaqMan探针方法执行关于马和驴物种的检测的研究，并且他们使用线粒体细胞色素b（cytb）基因设计引物和探针[1]。但是他们的研究中使用的方法在第30个循环（Ct 30）后不足以区分紧密相关的物种，并且出现非特异性反应。扩增子大小对于马物种是69 bp（碱基对），并且对于驴物种是119 bp。马特异性引物和探针组显示出牛和驴DNA的非特异性反应。并且对于驴特异性的引物和探针组引起与马DNA的交叉反应（Ct 30.77）。在这个应用中，发现对于马的检测极限是25ng和对于驴的检测极限是1 ng。

Doole等人描述了通过使用在线粒体细胞色素b（cytb）上设计的特异性引物和探针组的基于实时PCR的检测方法，以便鉴定在肉和肉产品中存在的牛、绵羊、猪、火鸡和鸡物种组织。对于猪特异性的引物和探针组显示出与牛、绵羊、鸡和火鸡的交叉反应。对于这些物种检测到的Ct值分别为31.13、37.08、30.00、34.64，并且对于猪的理论检测极限是0.02%。

Tanabe等人在线粒体细胞色素b基因上设计了对于猪、鸡、牛、绵羊和马特异性的引物和探针，并且用实时PCR TaqMan技术以100 fg/μl水平检测每个物种[3]。

Jonker等人也开发了通过使用物种特异性引物和探针组以0.01%水平用于鉴定加工的肉产品中存在的牛、猪、马、绵羊、鸡和火鸡物种的实时PCR方法[4]。

Frezza等人可以通过使用16S rRNA基因以0.01-0.05ng水平检测牛和绵羊物种，以及通过使用细胞色素b基因以0.5ng水平检测鸡和猪物种[5]。

K?ppel等人开发了通过使用β-肌动蛋白和促乳素受体基因以0.32-32ng水平用于检测牛、猪、鸡和火鸡物种的多重实时PCR方法[6]。

现有技术已知的申请，国际专利文件号WO2007119066，公开了致使食物中存在的肉类中的动物组织能够通过使用PCR技术进行检测的试剂盒。

发明概述

本发明的目的是实现包含用于检测其它肉产品中的驴肉的特异性引物探针组的试剂盒。