[发明专利]用于纯化聚乙二醇化的促红细胞生成素的方法

说明书

技术领域

本文报道了一种使用在SP Sephacryl S500HR柱上的线性梯度洗脱方法来纯化聚乙二醇化的促红细胞生成素的方法。

背景技术

蛋白在当今的医疗产品中具有重要作用。对于人应用而言，每种治疗性蛋白必须符合独特的标准。为了确保生物药物对人类的安全性，尤其必须除去生产过程中累积的副产物。为了满足管理规范，在生产过程之后必须进行一个或多个纯化步骤。其中，纯度、处理量和收率在确定适宜的纯化方法中起重要作用。

已经报道了下述治疗性蛋白的缀合物：例如，聚乙二醇(PEG)和白介素-6(EP0442724)，PEG和促红细胞生成素(WO01/02017)，包含内皮生长抑素和免疫球蛋白的嵌合分子(US2005/008649)，基于分泌型抗体的融合蛋白(US2002/147311)，包含白蛋白的融合多肽(US2005/0100991；人血清白蛋白US5,876,969)，聚乙二醇化的多肽(US2005/0114037)和促红细胞生成素融合物。

Necina，R.，等人(Biotechnol.Bioeng.60(1998)689-698)报道了用表现出高电荷密度的离子交换介质从细胞培养物上清液中直接捕获人单克隆抗体。在WO89/05157中，报道了一种通过对细胞培养基直接进行阳离子交换处理来纯化免疫球蛋白产物的方法。Danielsson，A.，等人，J.Immun.Meth.115(1988)79-88描述了从小鼠腹水中一步纯化单克隆IgG抗体。在WO2004/024866中报道了一种通过离子交换色谱法来纯化多肽的方法，其中使用梯度洗脱将目标多肽与一种或多种污染物拆分开。在EP0530447中，报道了一种通过三个色谱步骤的组合来纯化IgG单克隆抗体的方法。Yu，G.，等人，Process Biotechnol.42(2007)971-977报道了单聚乙二醇化的白介素-1受体拮抗剂的容易的纯化。Wang，H.，等人，Peptides26(2005)1213-1218报道了通过两步阳离子交换色谱法来纯化在大肠杆菌(E.coli)中表达的hTFF3。Yun，Q.，等人(Yun，Q.，等人，J.Biotechnol.118(2005)67-74)报道了通过两个连续的离子交换色谱步骤来纯化聚乙二醇化的rhG-CSF。

发明内容

本文报道了一种通过阳离子交换色谱法从反应副产物或未反应的原料中纯化蛋白缀合物的方法，所述蛋白缀合物包含促红细胞生成素和单个聚(乙二醇)残基。已经发现，通过采用阳离子交换色谱材料SP Sephacryl S500HR和线性梯度洗脱，可以在单个步骤中以高纯度和收率获得包含促红细胞生成素和单个聚(乙二醇)残基的缀合蛋白，其中在柱中已经预先施加了具有确定电导率的缓冲溶液。

因而，在一个方面，本文报道了一种获得包含促红细胞生成素和单个聚(乙二醇)残基的融合蛋白的方法，所述方法包括下述步骤：

a)将具有约21mS/cm的电导率的溶液施加于包含SP Sephacryl S500HR色谱材料的色谱柱上，

b)将一种溶液施加于a)的柱上，所述溶液包含游离的促红细胞生成素以及促红细胞生成素和聚(乙二醇)的融合蛋白(其中每个促红细胞生成素分子具有一个或多个聚(乙二醇)残基)的混合物，

c)将具有约21mS/cm的电导率的溶液施加于所述柱，并由此回收包含2个或更多个聚(乙二醇)残基的融合蛋白，

d)向所述柱施加一种溶液，所述溶液具有连续地且线性地递增的一直到至少60mS/cm的最终值的电导率，并由此分别回收包含促红细胞生成素和单个聚(乙二醇)残基的融合蛋白和游离的促红细胞生成素，其中首先获得包含促红细胞生成素和单个聚(乙二醇)残基的融合蛋白。

在一个实施方案中，所述具有约21mS/cm的电导率的溶液是pH值为pH2.5至pH3.5的溶液。在一个实施方案中，所述具有约21mS/cm的电导率的溶液是pH值为pH2.5至pH3.5的磷酸(盐)缓冲溶液。

在一个实施方案中，在步骤d)中施加的溶液的pH值为pH2.5至pH3.5。在一个实施方案中，施加具有连续地且线性地递增的电导率的溶液是一直到约70.0mS/cm的最终电导率值。

在一个实施方案中，具有连续地且线性地递增的电导率的溶液是具有连续地且线性地递增的氯化钠浓度的溶液。

在一个实施方案中，所述促红细胞生成素是人促红细胞生成素。在一个实施方案中，所述人促红细胞生成素具有SEQ ID NO：01或SEQ ID NO：02的氨基酸序列。