[发明专利]慢病毒载体的半稳定生产

说明书

发明领域

本发明涉及用于基因治疗的慢病毒载体(LV)的生产。更具体地讲，本发明涉及半稳定慢病毒包装细胞系以及使用杂合杆状-腺伴随病毒(baculo-Adeno associated virus (AAV))载体而制备包装细胞系的方法，用于慢病毒结构蛋白和调控蛋白的稳定整合。

背景

自从2001年针对AIDS的首次LV I期临床试验之后，研究基于HIV的LV作为基因递送载体的38个I-II期和2个II-III期试验已经经过当局的审查；它们中的3个仍然处于审查中。最大数量的试验包括单基因病，其中的一些具有高发病率，例如库利氏贫血(Cooley’s anemia) β-重型地中海贫血(4个试验)。其次是癌症和感染性疾病，主要是HIV-1感染。通常，I/II期试验中招募的患者数量是有限的，但在III期中则不是。因此迫切需要第2代(基于LTR)和第3代(基于SIN) LV的稳定包装细胞系，以应付LV大规模生产的需要，大量用于未来有希望的III期试验。基于瞬时方案的LV生产在全局应用的安全性、成本和再现性的观点来看确实是不现实的。

越来越多的证据显示，新近开发的用于基因治疗的病毒整合载体LV具有广泛应用性，可转导终末分化的或处于周期中的细胞，对维持长期转基因表达是理想的并且比先前畏惧的更安全。在过去20年里对莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV) γ-逆转录病毒载体(γRV)积累的经验指导了LV递送系统的快速发展，其开发起源于克服逆转录病毒不能转导非分裂细胞(non diving cell)的需要。具体地讲，自失活(SIN)转移载体的产生使得在人类临床试验中大量使用LV的前景更可行¹，只要发展和优化同样有效的制备方法。然而，与通过若干人类和鼠的市售包装细胞系就可制备的γRV相反，不仅用于研究级、而且用于GMP级的目前的LV生产几乎都通过瞬时转染。该技术昂贵，难以标准化和规模化并且需要大量下游验证试验。此外，与稳定生产相比，在瞬时生产期间可能通过包装和转移载体构建体中病毒序列间的重组而产生的复制型慢病毒(RCL)的风险，是虽罕见但可能性较高的事件。

用于LV的与逆转录病毒等效的稳定包装细胞系的开发变得更缓慢和更困难，因为，与γ逆转录病毒相反，慢病毒蛋白例如env、蛋白酶和某些辅助蛋白的表达对于人体细胞而言是有毒的。为了克服该问题，在包装细胞的很早期形式中存在的辅助基因，之后在最新一代中被去掉。第一代基于SIV和HIV的LV包装细胞系得自猴Vero，或人COS、HeLa和293的贴壁细胞^2-5，其经工程化具有携带极少关键性修饰的慢病毒基因组，例如除去了包装信号。事实上gp120 env和大部分辅助基因都保留下来。所得LV滴度非常低^2-5，而且更重要的是这些载体的可能应用必定限制在CD4⁺ T细胞，对于抗AIDS基因治疗方法而言。随后，gp120 env被来源于疱疹性口炎病毒的糖蛋白(VSV-G)取代并且去掉了所有辅助基因，因为已经证明对于有效LV制备而言是可有可无的。为了避免对VSV-G也描述过的毒性，通过各种不同系统，例如Tet、蜕皮素、Rev以及Tet和cumate的组合，有条件地诱导其表达⁶。同样，为了在克隆选择期间降低病毒蛋白酶的毒性效应，已经描述了经Tet以及强力霉素和cumate药物组合诱导的gag-pol基因的有条件的表达⁶。在所有这些系统中，通过质粒DNA瞬时转染而整合gag-pol基因、rev基因和env基因，然后药物选择和细胞克隆。

为了实现真实的稳定包装细胞系的一个关键性问题就是选择最好的病毒基因递送载体。大部分研究人员通过质粒DNA瞬时转染而整合gag-pol基因、rev基因和env基因，然后药物选择和细胞克隆^2-9。已知该技术随时间推移而遭受基因沉默和基因损失¹⁰，这二者均可危害包装克隆的长期稳定性。

已经公开了替代的基因递送载体，尤其是在STAR¹¹和在新近开发的GPRG-TL-20¹²包装细胞系中，其中通过MLV-穿梭载体将gag基因、pol基因和rev基因整合到HEK293T细胞中。2拷贝重新编码的gag-pol基因稳定地整合在STAR中，而对于GPRG-TL-20则没有这类信息¹²。与转染env基因的STAR相反，在GPRG-TL-20中所有残留病毒基因都通过SIN-MLV而引入。