[发明专利]慢病毒载体的半稳定生产

权利要求书

1. 一种用于慢病毒结构蛋白和调控蛋白的稳定表达的系统，其由以下组成：

i. 杂合载体，其包含含有侧翼为AAV ITR并包含2个表达盒的整合盒的杆状病毒骨架，其中第一表达盒编码慢病毒gag基因和pol基因，第二个编码慢病毒rev和选择标记，和

ii. 含有处于启动子控制之下的AAV rep可读框(ORF)的表达质粒。

2. 权利要求1的系统，其中所述杂合载体的2个表达盒是尾-尾的方向并且每个由组成型启动子和多聚A驱动。

3. 权利要求1或2的系统，其中所述启动子选自CMV、CMV IE、PGK、SV40、eF1α、SFFV和RSV。

4. 权利要求1-3中任一项的系统，其中所述启动子是CMV IE启动子。

5. 前述权利要求中任一项的系统，其中所述选择标记选自潮霉素、卡那霉素、新霉素、zeomycin的抗性基因。

6. 权利要求5的系统，其中所述选择标记是潮霉素抗性基因。

7. 前述权利要求中任一项的系统，其中所述选择标记是克隆在内部核糖体进入位点(IRES)下游。

8. 前述权利要求中任一项的系统，其中所述rep蛋白是rep78。

9. 一种由稳定表达慢病毒gag、pol和rev的细胞组成的半稳定慢病毒包装细胞系，其特征在于这类细胞含有稳定整合到其基因组中的侧翼为AAV ITR并包含2个表达盒的至少一个拷贝的整合盒，其中第一表达盒编码慢病毒gag基因和pol基因，第二个编码慢病毒rev和选择标记。

10. 权利要求9的半稳定慢病毒包装细胞系，其中所述细胞是选自HEK293、HEK293-T、HEK293-SF、TE671、HT1080或HeLa的人细胞系。

11. 权利要求9或10中任一项的半稳定慢病毒包装细胞系，其中所述2个表达盒是尾-尾的方向并且每个由组成型启动子和多聚A驱动。

12. 权利要求9或11中任一项的半稳定包装细胞系，其中所述启动子选自CMV、CMV IE、PGK、SV40、eF1α、SFFV和RSV。

13. 权利要求12的半稳定包装细胞系，其中所述启动子是CMV IE启动子。

14. 权利要求9-13中任一项的半稳定包装细胞系，其中所述选择标记选自潮霉素、卡那霉素、新霉素、zeomycin的抗性基因。

15. 权利要求14的半稳定包装细胞系，其中所述选择标记是潮霉素抗性基因。

16. 权利要求9-15中任一项的半稳定包装细胞系，其中所述选择标记是克隆在内部核糖体进入位点(IRES)下游。

17. 一种用于产生慢病毒载体的方法，其包括：

i. 培养权利要求9-16中任一项的半稳定包装细胞系，

ii. 在所述半稳定包装细胞系中插入env基因，

iii. 在所述半稳定包装细胞系中插入转移载体。

18. 权利要求17的方法，其中所述env基因选自VSV-G env、MLV 4070 env、RD114 env、嵌合包膜蛋白RD114-TR、嵌合包膜蛋白RD114-pro、杆状病毒GP64 env或GALV env或其衍生物。

19. 权利要求17或18的方法，其中所述env基因是编码嵌合包膜蛋白RD114-TR的基因。