[发明专利]具有前导序列功能的多核苷酸

说明书

涉及序列表

本申请包含计算机可读形式的序列表。该计算机可读形式通过提述并入本文。

发明背景

技术领域

本发明涉及具有前导序列功能的多核苷酸。具体而言，本发明涉及在真菌宿主细胞中具有前导序列功能的多核苷酸。本发明亦涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及使用本发明的多核苷酸产生多肽的方法。

背景技术

在真菌宿主细胞，特别是丝状真菌宿主细胞如曲霉属(Aspergillus)细胞中异源蛋白的重组产生，可对于以商业上重要的量产生所述蛋白提供更理想的媒介。

异源蛋白的重组产生一般通过下述实现：构建表达盒，其中编码所述蛋白的DNA置于启动子的表达调控下，所述启动子是从受调节的基因切出的，且适于宿主细胞。将所述表达盒导入宿主细胞。然后，通过在表达盒上所包含的启动子的正常功能所需的诱导条件下培养经转化的宿主细胞来实现异源蛋白的产生。

蛋白的重组表达的改善一般需要新的调节序列的可用性，所述调节序列适于在宿主细胞中调控所述蛋白的表达。所述调节序列可为合适的前导序列，其为对于宿主细胞翻译重要的mRNA的未翻译区。前导序列可操作地连接于编码所述多肽的核苷酸序列的5’端。

用于丝状真菌宿主细胞的公知的前导序列之前已从例如对于米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶和构巢曲霉(Aspergillus nidulans)丙糖磷酸异构酶的基因获得。

本发明的一个目的是提供用于在真菌宿主细胞中使用的新前导序列，并进一步提供用于在真菌宿主细胞中使用所述新前导序列产生多肽的改善的方法。

发明内容

在第一个方面，本发明涉及具有前导序列功能的分离的多核苷酸，其选自下组：

(a)多核苷酸，其包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO:1或2具有优选至少60%，更优选至少65%，更优选至少70%，更优选至少75%，更优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，且最优选至少95%序列同一性；

(b)多核苷酸，其在优选至少中等-高严格条件，最优选至少高严格条件，且甚至最优选至少非常高严格条件下与SEQ ID NO:1或2的多核苷酸杂交；

(c)SEQ ID NO:1或2的包含一个或多个(几个)核苷酸的取代、缺失和/或插入的变体。

本发明进一步涉及包含本发明的第一个方面的分离的多核苷酸的核酸构建体如表达载体和质粒，以及宿主细胞。

最后，本发明涉及使用本发明的多核苷酸产生多肽的方法。

定义

序列同一性：参数“序列同一性”描述两个核苷酸序列之间的相关性。

就本发明而言，两个氨基酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice等,2000,Trends in Genetics16:276-277)，优选3.0.0版或更高版本的Needle程序中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)来测定。使用的可选参数为缺口开放罚分(gap open penalty)10，缺口延伸罚分(gap extension penalty)0.5和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最高同一性(longest identity)”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性，并计算如下：

(同样的残基×100)/(比对长度－比对中缺口的总数)

就本发明而言，两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列同一性程度使用如EMBOSS软件包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice等,2000,见上文)，优选3.0.0版或更高版本的Needle程序中所执行的Needleman-Wunsch算法(Needleman和Wunsch,1970,见上文)来测定。使用的可选参数为缺口开放罚分10，缺口延伸罚分0.5和EDNAFULL(NCBINUC4.4的EMBOSS版)取代矩阵。使用Needle标记为“最高同一性”的输出结果(使用-nobrief选项获得)作为百分比同一性，并计算如下：