[发明专利]诱导型启动子在乙醇酸的产生中的用途

说明书

技术领域

本发明涉及诱导型启动子在通过发酵产生乙醇酸中的用途。诱导型启动子的使用导致更稳定的乙醇酸生产株。

发明背景

乙醇酸(HOCH₂COOH)(glycolic acid或glycolate)，是α-羟基酸家族羧酸中最简单的成员。乙醇酸在非常小的分子上具有双官能性，即具有醇和中等强酸官能团。其性质使其非常适于广泛的消费和工业应用，包括用于水井再生(water well rehabilitation)，皮革工业，油气工业(oil and gas industry)，洗涤和纺织品工业，以及作为个人护理产品的成分。

乙醇酸亦可用于产生多种聚合材料，包括含聚乙醇酸的热塑性树脂。包含聚乙醇酸的树脂具有良好的阻气性质(gas barrier property)，且此类包含聚乙醇酸的热塑性树脂可用于制备具有该性质的包装材料(例如饮料容器等)。聚酯聚合物在水性环境中以可控制的速率逐渐水解。该性质使其可用于生物医学应用如可溶解的缝线，以及用于需要控制释放酸以减少pH的应用中。目前，在美国每年消费超过15,000吨的乙醇酸。

尽管乙醇酸作为痕量成分天然存在于甘蔗、甜菜、葡萄和果实中，其主要是合成产生的。用于产生乙醇酸的技术描述于文献或专利申请中。例如，Mitsui Chemincals,Inc.描述了一种使用微生物从在其末端具有羧基的脂族多元醇产生该羟基羧酸的方法(EP 2 025 759 A1和EP 2 025 760 A1)。该方法是如由Michihiko Kataoka在关于使用乙二醇氧化微生物产生乙醇酸的论文中所述的生物转化(Biosci.Biotechnol.Biochem.,2001)。

乙醇酸亦如由Dupont de Nemours and Co在WO2006/069110和US7,445,917中所公开的使用具有改善的腈水解酶活性的突变体腈水解酶从乙醇腈(glycolonitrile)通过生物转化产生。这些文献教导了使用甲醛和氰化氢作为前体合成乙醇腈，并使用具有腈水解酶活性的酶催化剂以从乙醇腈合成乙醇酸。该工艺的主要缺点是乙醇腈是在痕量酸或碱影响下可剧烈聚合的化学物质，具有起火或爆炸的危险。该物质在受热时分解，产生含有氰化氢和氮氧化物的有毒烟雾。因此其被列为极其危险的物质。

使用细菌菌株通过发酵从糖，特别是从可再生资源产生乙醇酸的方法在Metabolic Explorer的专利申请(WO 2007/141316和WO 2010/108909)中公开。

乙醇酸的生物产生需要来自细菌的中心代谢(central metabolism)的中间物的形成(参见图1)。位于Krebs循环和乙醛酸支路的交点的异柠檬酸是其中之一(Tricarboxylic acid cycle and glyoxylate bypass,综述于Neidhardt,F.C.(主编),R.Curtiss III,J.L.Ingraham,E.C.C.Lin,K.B.Low,B.Magasanik,W.S.Reznikoff,M.Riley,M.Schaechter,和H.E.Umbarger(编).1996.Escherichia coli and Salmonella:Cellular and Molecular Biology.American Society for Microbiology)。异柠檬酸或是(1)裂解为琥珀酸和乙醛酸，该反应由aceA基因编码的异柠檬酸裂合酶催化，或是(2)由icd基因编码的异柠檬酸脱氢酶转化为α-酮戊二酸。在专利申请EP 2 027 277中描述的在先研究显示了通过具有icd基因减弱表达的菌株良好地产生乙醇酸。减少TCA循环中的通量以迫使其转向乙醛酸支路显著增加了乙醇酸产生的产率，然而同时削弱了该菌株。

具有icd基因减弱表达的菌株当生长许多世代时不稳定，这对于工业使用是严重的缺点。作者通过使用诱导型启动子发现了该问题的解决方案。