[发明专利]用于人多能细胞培养的简化基础培养基

说明书

相关申请的交叉引用

不适用。

关于联邦政府资助的研究或开发的声明

本发明受到政府支持，在国立卫生研究院授予的ES017166支持下完成。政府在本发明中有一定权利。

背景技术

多能细胞，例如胚胎干(ES)细胞和诱导性多能干(iPS)细胞，具有分化为所有三种原胚层细胞的潜力(Thomson等，Science282,1145-1147(1998))。已证实多能细胞的巨大发展潜力可用于基础研究和临床应用。人多能细胞培养的许多基础方法，例如生长培养基、铺板和其它条件，已得到开发与改进(Ludwig等，Nat.Biotechnol24,185-187(2006)；Ludwig等，Nat.Methods3,637-646(2006))。例如，当在含有胎牛血清(FBS)的培养基中，在鼠胚胎成纤维细胞(murine embryonic fibroblast,MEF)饲养细胞上起始培养人ES细胞时，现可获得完全限定培养基(fully defined media)和限定的蛋白质基质(Ludwig等，Nat.Biotechnol24,185-187(2006))。

在过去的十年，多能细胞培养方法有显著进展。开发了若干生长培养基，其为多能细胞的生存和扩增提供基础营养物质和生长因子，并直接决定细胞如何生长与分化。TeSR^TM是首批限定培养基中的一种，其在无饲养细胞或条件培养基时，支持多能细胞经多次培养传代仍保持在未分化状态(Ludwig等，Nat.Methods3,637-646(2006)；美国专利号7,449,334，各文件通过引用纳入本文并如其完整形式)。TeSR^TM除本身包含52种成分的基础培养基DMEM/F12外，还包含18种成分(表1)。

可用于多能细胞培养的不同生长培养基的多样性造成了研究结果不一致。现用于多能细胞衍生和生长的培养基(包括完全限定培养基)含有会以不同方式影响多能细胞的成分。在本文描述的本发明之前，仍然未知各培养基成分在细胞培养中如何(单独地还是与其它成分联合)影响不同多能细胞的功能，如活力、多能性或分化。

例如，在大多数培养基中含量最丰富的蛋白质——白蛋白，是一种脂质载体，并且同样可以通过其联合的脂质来影响多能性的分化或保持。白蛋白及其联合的脂质的质量决定它是否能用于人多能细胞培养。然而，白蛋白的质量随其来源而定，差异很大，甚至产自重组遗传材料时差异也很大，造成在不同等效实验条件下进行的实验之间的差异。同样，虽然可获得克隆的人血清白蛋白，但由于其价格相对昂贵而很少用于常规实验。

从培养基中去除白蛋白的努力已被证实是不成功的。去除白蛋白或TeSR中存在的任何其它生长因子都会导致人ESC培养性能显著下降，例如细胞活力、增殖和多能性的减少(Ludwig等，Nat.Biotechnol24,185-187(2006))。

为充分开发多能细胞用于药物发现、测试和移植治疗的潜力，需要使这些细胞在完全限定且理想的无异源条件下衍生和生长。因此，本领域中存在对不含引起不一致性的成分的培养基的未被满足的需求，以保持对多能细胞培养条件的控制。本技术领域中特别需要多能细胞培养基，其仅包含支持对特定培养目标而言有重要性的多能细胞功能的那些成分。

简述

本发明一般涉及用于衍生和培养多能细胞的培养基、组合物和方法，更具体地涉及用于多能细胞的完全限定培养基。

本发明的第一方面概括为支持多能细胞的活力、生长和多能性的无白蛋白培养基。

在所述第一方面的一些实施方式中，所述培养基包含硒。

在所述第一方面的一些实施方式中，所述培养基包含NODAL。

在所述第一方面的一些实施方式中，所述培养基包含转铁蛋白。

在所述第一方面的一些实施方式中，所述培养基包含转化生长因子-β(TGF-β)。

在所述第一方面的一些实施方式中，所述培养基仅包含水、盐、氨基酸、维生素、碳源、胰岛素和成纤维细胞生长因子(FGF)，各所述成分的量足以支持多能干细胞的活力。

在所述第一方面的一些实施方式中，所述培养基仅包含水、盐、氨基酸、维生素、碳源、胰岛素、FGF、硒、转铁蛋白、以及TGF-β和NODAL二者之一，各所述成分的量足以支持多能干细胞的增殖。

在所述第一方面的一些实施方式中，所述培养基支持多能细胞在传代、冷冻、增殖、多能性、衍生和克隆化后的存活。