[发明专利]向细胞中导入核酸的方法以及核酸复合物

说明书

技术领域

本发明涉及向靶细胞中导入双链核酸分子的方法、用于该方法的核酸载体的改良、以及利用前述核酸载体与双链核酸分子得到的核酸复合物。

背景技术

RNA干扰(RNAi)是以碱基长为21~25左右的低分子量双链RNA(siRNA)为诱因，碱基序列特异性地分解mRNA，从而抑制特定基因的表达的现象，与已经进入临床试验阶段的反义核酸相比，RNA干扰的有效性和碱基序列特异性更优异，因此强烈期待其在医药中的应用。然而，还残留有siRNA向细胞内的导入、在细胞内的稳定性和抑制效果的持续性的确保等大量需要解决的问题。

由于包含siRNA的聚(寡)核苷酸为多聚阴离子，因此直接使用时，与疏水性的细胞膜的亲和性低，难以导入细胞内。另外，由于核酸酶会分解外源性的核酸，为了确保其在细胞内的稳定性和抑制效果的持续性，需要保护其不受细胞内存在的核酸酶的影响。鉴于上述问题，针对核酸向细胞内的导入，至今为止提出了各种方法，但这些方法大致分为使用病毒载体的方法和不使用病毒载体的方法。

病毒载体是指欠缺复制能力的病毒，在使用了病毒载体的基因导入方法中，具有可以利用病毒的增殖方式的优点，使从进入细胞内至蛋白质合成均高效地推进这样的优点。作为病毒载体，使用来源于腺病毒、反转录病毒、慢病毒、腺相关病毒（アデノ随伴ウイルス）的重组病毒载体(例如，参照专利文献1、非专利文献1)。然而，使用病毒载体的方法被指出存在因病毒而致癌等的危险性，实际上也确认存在死亡病例。另外，存在因产生病毒中和抗体而导致失活等问题，同时还伴随着难以大量生产、难以进行品质管理的问题。

另一方面，作为不使用病毒载体而向靶细胞内导入核酸的方法，提出了磷酸钙法、电穿孔法、脂质体法、脂转染物法、显微注射法、流体动力学法、利用抗体、肽等载体与核酸的复合物的方法等各种方法(例如，参照非专利文献1)。

然而，不使用病毒载体的现有核酸导入方法中，用于将以siRNA为首的核酸导入细胞中的基因医药构建无法说是充分的。即，正在寻求不限细胞种类、兼具实现高效且以高重现性导入核酸、提高对细胞内的核酸酶的耐性、提高序列特异性地与靶核酸结合以及亲和性、低细胞毒性等性质的新型核酸载体。

截止至今，开发了各种向核酸载体、细胞中导入核酸的方法，近年来，使用了生物体内的信号肽等功能性肽的、向核酸载体和细胞中导入核酸的方法备受瞩目。例如有以下方法：使用核定位化信号肽(例如，参照专利文献2、3)、其它信号肽(例如，参照专利文献4)、设计肽(例如，参照专利文献5)，向细胞内导入阴离子性核酸的方法；组合使用利用糖修饰肽使细胞特异性提高的核酸载体(例如，参照专利文献6)、两亲性聚合物与肽结合而成的功能性分子(例如，参照专利文献7)、已有的核酸载体与肽的方法(例如，参照专利文献8)等。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开平10-146191号公报

专利文献2：日本特表2003-514564号公报

专利文献3：日本特开2001-288200号公报

专利文献4：日本特表平10-506001号公报

专利文献5：日本特开2002-316997号公报

专利文献6：日本特开平11-290073号公报

专利文献7：日本特表2003-503370号公报

专利文献8：日本特开2004-65238号公报

非专利文献

非专利文献1：仲岛一范、北村义浩编著、“必ず上手くいく遺伝子導入と発現解析プロトコール”、羊土社、2003年9月、ISBN9784897064116

发明内容

如上所述，截止至今，开发了向各种核酸载体和细胞中导入核酸的方法，但尚无已经确定的方法。另外，这些方法中大多以DNA为靶，因此并不一定适合将低分子量且反应性比DNA还高的siRNA导入至细胞中。

本发明是鉴于所述情况而进行的，其目的在于，提供一种向细胞中导入核酸的方法、核酸载体和核酸复合物，所述方法能够将siRNA等双链核酸分子高效地导入靶细胞中，能够对双链核酸分子赋予对核酸酶的高耐性，且由细胞毒性带来的副作用风险小。

用于实现前述目的的本发明的第一实施方式通过提供下述(1)~(9)所述的向细胞中导入核酸的方法来解决上述问题。