[发明专利]高热增强的体外免疫识别

说明书

技术领域

本发明涉及通过在高热条件下进行孵育而产生测试抗原特异性细胞介导免疫应答的一般方法；更具体地，本发明涉及一种通过在高热条件下进行孵育，另外视情况添加IL-7并且/或者阻断IL-10而产生测试抗原特异性细胞介导免疫应答的方法。更具体地，本发明提供一种使用全血或其他合适生物样品以产生针对抗原的细胞介导应答的方法。该方法可用于人类、家畜和兽类、以及野生动物用途的治疗及诊断方案。

细胞介导免疫应答的测量对于许多传染病的免疫诊断(作为免疫活性的标记)以及对非已抗原(即感染和疫苗)的T细胞应答的检测而言是重要的。

本发明提供一种通过在高热条件下在至少一种抗原存在下对包含取自哺乳动物的能够决定免疫应答的免疫系统细胞的样品进行孵育(incubating)而产生并且/或者评估哺乳动物中测试抗原特异性细胞介导免疫应答的方法。该方法可包括补充步骤，该补充步骤包括添加至少一种免疫调节剂(例如IL-7和/或抗体结合IL-10)。然后，对至少一种免疫信号分子(例如IP-10和/或IFN-γ)的产生进行检测。然后，免疫信号分子的存在和水平可指示受试者细胞介导应答水平。

背景技术

高热孵育

一般来说，发烧样(fever-like)温度在免疫学方法中的有用性是相当有争议的。

已发表了一些关于差异孵育温度在免疫诊断方法中的效果的研究，这些研究报道了：当对含有丝裂原的牛全血进行孵育时，与较低温度(大约21℃)孵育相比，37.5℃孵育中的IFN-γ产生减小(Waters等人，2007年；Robbe-Aust erman等人，2006年)。然而，干扰素(IFN)-γ释放试验(IGRA)的制造商建议37℃的孵育温度(www.cellestis.com)，这似乎获得相当好的IFN-γ应答，尽管据我们所知支持孵育温度选择的数据尚未发表。

目前，对于提高温度在体外试验中如何影响免疫系统细胞的研究是不能令人信服的。在高热温度下对免疫系统细胞进行孵育的研究结果，在关于高达40-41℃的温度是否增强免疫应答方面是相互矛盾的。

一些研究已显示在高热孵育中免疫功能的改善。在由Basu等人进行的研究中使用经纯化和“热休克”的(在41℃下进行6小时孵育)加载有OVA特异性S IINFEKL肽的小鼠树突状细胞(DC)，并且将“热休克”小鼠树突状细胞的效果与和对SIINFEKL肽为特异性的T细胞系有相互作用的正常小鼠树突状细胞的效果进行了比较。这些研究证明，与正常树突状细胞(Basu等人，2003年)相比，“热休克”的树突状细胞能够增加IFN-γ的产生高达3倍。

另一项研究证明，当把人外周血单核细胞在40或41℃下维持6小时，接着在37℃下用丝裂原或破伤风类毒素进行刺激时，可增加产生IFN-γ的T细胞的数量并且提高增殖反应。向MHC II类中添加单克隆抗体可完全消除这些效果(Huang等人，1996年)。已证明，用PPD(结核菌素纯蛋白衍生物)进行刺激可获得类似的效果(Kappel等人，1991年)。似乎高热是通过上调MHC II类分子和共刺激分子(如抗原递呈细胞上的B7家族膜CD80/86)而导致这些效果。

然而，这些研究均未证明较高温度(即高热条件)孵育对疾病特异性抗原识别的效果。

最近的现有技术是由Schiller等人在2009年进行的研究，他们研究了疾病特异性抗原识别。在此研究中，在25、29、33和39℃的各种温度下对取自结核分枝杆菌感染牛的全血进行孵育，并且对针对结核分枝杆菌特异性抗原ESAT6和CFP10的IFN-γ应答进行了研究。然而，作者并未观察到33℃与39℃的孵育之间存在IFN-γ应答的差异(未在37℃下对样品进行测量)(Schiller等人，2009年)。这与本发明的教导是矛盾的，在本发明中我们证明了高热条件下的孵育可增强测试抗原特异性细胞介导免疫应答。

IL-7和抗IL-10

理想的是进一步提高测试抗原特异性细胞介导的免疫应答。可以通过在孵育步骤中添加免疫调节剂而实现此目的。我们已举例说明在本发明中通过添加IL-7并且/或者中和抗体结合IL-10而实现的此提高。

Feske等人已研究了向ESAT6/CFP10刺激的血液(取自肺结核患者)中添加IL-7的效果并且证明IFN-γ产生的增加(Feske等人，2008年)。然而，从来未测试或建议利用高热与IL-7的组合来提高生物标记应答。