[发明专利]HMGB1作为炎性肠病病情的生物标志物的用途、其在粪便样品中的非侵入性检测方法及其试剂盒

说明书

描述

本发明与检测和诊断人慢性炎性肠病(IBD“炎性肠病”)的材料和方法有关。尤其，本发明描述了一种通过粪便提取物中HMGB1蛋白的存在来测定人炎性肠病病情、以及该蛋白质与慢性炎性肠病特别是克罗恩病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)发病机理的牵连的非侵入性方法。本发明还包括用于实现该方法的比色试剂盒。

发明领域

高迁移率族蛋白1(HMGB1)是一种与非组蛋白染色质相关联的非组蛋白核蛋白质，表现为能够通过诱导炎症反应来应答组织损伤的刺激(1)的DAMP(伤害相关分子模式)分子原型。HMGB1在诸如LPS、TNFα、IL-1β、IL-6和IL-8(4)之类的促炎症刺激后由巨噬细胞(2)和肠上皮细胞(3)主动分泌，并且它由坏死细胞而非凋亡细胞释放(5)。分泌至胞外空间的HMGB1与以下不同的分子形成高炎症复合体：单链DNA、LPS、IL-1β和核小体，其与它们各自的受体诸如TLR9、TLR4、IL-1R和TLR2相互作用，激活固有免疫。另外，HMGB1可结合糖基化最终产物受体RAGE(高级糖基化最终产物受体)，但不形成复合体(6)。

胞外HMGB1诱导炎症介质的产生(4)，并可能在自身免疫性疾病或炎性疾病的发病机理中扮演重要角色，这些疾病包括类风湿性关节炎(7)、系统性红斑狼疮(8)和多发性肌炎(9)。美国专利No.6,303,321描述的发明涉及治疗败血症的药物组合物。该药物组合物包括作为活性物质的有效量的HMGB1拮抗剂或抑制剂。在HMGB1的拮抗剂中，优选使用结合HMGB1蛋白的抗体、HMGB1编码基因的反义序列、及HMGB1受体的拮抗剂。因此，该发明的主题还有治疗败血症的方法，包括施用有效量的HMGB1拮抗剂。该发明还提供了一种诊断和预后方法，用于监测患者病情的严重程度和预测具有休克样症状或显示相关联症状的患者的败血症及相关病情的可能临床病程。该诊断和预后方法包括测定样品中特别是在血清或全血中HMGB1蛋白的浓度，将其与HMGB1标准浓度比较。较高水平的HMGB1是预后不良或可能发生毒性反应的指标。该诊断方法也可应用于其他组织或液体空间例如脑脊液或尿液。

HMGB1和胃肠道：技术发展水平

压力、组织损伤或肠粘膜微生物抗原症状激活参与固有免疫应答的细胞，例如巨噬细胞和树突状细胞，从而引发炎症反应。

随炎症刺而激释放到细胞外基质的HMGB1的存在似乎通过改变肠道上皮细胞的渗透性和导致微生物抗原进入的增多来显著影响肠屏障功能。事实上，体外和体内的研究已将由受免疫刺激的肠上皮细胞或由其他免疫细胞分泌的HMGB1的存在与肠屏障功能障碍关联起来(10-15)。此外，由于炎症细胞因子的释放，HMGB1也潜在地参与结肠炎症，正如在动物模型中(16，17)、以及在结肠炎的坏死性形式(18，19)中所证实的。

通过抗HMGB1分子来减少所分泌的HMGB1似乎与肠屏障损坏和粘膜炎症两者的改善皆相关(11，13，14，16，19，20)。

从患者获得的组织样本中的HMGB1蛋白的存在和量已经被用作肠道癌症特别是结肠和直肠癌症的诊断和预后标志物，正如在美国专利申请2006/0188883中描述。然而，众所周知，癌症疾病是一种与炎性肠病非常不同的病情。此外，该专利申请的目标是只在生物组织的使用中适用，并没有提供与粪便材料的使用有关的参考。

在最近一篇由Davè等所著的文章(16)中显示了在有慢性结肠炎的小鼠模型中使用抗炎剂如丙酮酸乙酯以减少HMGB1分泌的结果。对粪便样品进行的测试表明施用丙酮酸乙酯后大便中HMGB1水平降低。

但是，Davè对结肠炎的研究中进行的实验仅提到了小鼠模型，而且已知这样得到的结果并非总是能够自动扩展到人及其疾病；事实上，通过使用动物模型得到的结果经常与相应的人类疾病完全不一致，在分子标记物方面、在疾病的临床病程以及在对具体治疗的应答方面皆是如此。

此外，在该研究中使用的小鼠模型还采用了转基因的小鼠品系，其对于IL-10即一抗炎细胞因子的基因编码被删除了，这导致小鼠的结肠炎。这与人类疾病相比是一种颇为不同的状态，在人类疾病中是由复杂得多的促成因素决定了疾病的发作。

事实上，众所周知，在实验室动物模型中绝对无法再现表征人类的遗传和环境易变性。特别是，炎性肠病是多因素疾病，其中遗传和环境易变性在疾病的发作和发展中扮演重要角色。